Observación directa de los estados conformacionales de PIEZO1.

Nature volumen 620, páginas 1117–1125 (2023)Cite este artículo

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Detalles de métricas

Los PIEZO son canales iónicos mecanosensibles que convierten la fuerza en señales quimioeléctricas1,2 y tienen funciones esenciales en diversos entornos fisiológicos3. Los estudios in vitro han propuesto que los canales PIEZO transducen la fuerza mecánica mediante la deformación de extensas láminas de dominios transmembrana que emanan de un poro central conductor de iones4,5,6,7,8. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo estos canales interactúan con su entorno nativo y qué movimientos moleculares subyacen a la activación. Aquí observamos directamente la dinámica conformacional de las láminas de moléculas PIEZO1 individuales en una célula mediante imágenes de fluorescencia nanoscópica. En comparación con modelos estructurales anteriores de PIEZO1, mostramos que las palas se expanden significativamente en reposo por la tensión de flexión ejercida por la membrana plasmática. El grado de expansión varía dramáticamente a lo largo de la hoja, donde la disminución de la fuerza de unión entre los subdominios puede explicar una mayor flexibilidad de la hoja distal. Utilizando moduladores químicos y mecánicos de PIEZO1, mostramos que la expansión de la pala y la activación del canal están correlacionadas. Nuestros hallazgos comienzan a descubrir cómo se activa PIEZO1 en un entorno nativo. De manera más general, a medida que detectamos de manera confiable cambios conformacionales de nanómetros individuales de poblaciones de canales, esperamos que este enfoque sirva como marco para el análisis estructural de proteínas de membrana a través de imágenes nanoscópicas.

La capacidad de detectar y transducir información mecánica del entorno es fundamental para una amplia variedad de procesos fisiológicos en todos los ámbitos de la vida9. Los canales de mecanotransducción aprovechan el trabajo mecánico para abrir directamente un poro conductor de iones en respuesta a perturbaciones en la membrana celular, iniciando la señalización celular10. Los PIEZO son una familia de canales de mecanotransducción que se encuentran en Eukarya1,2 y median en una amplia gama de procesos fisiológicos en mamíferos, incluida la sensación táctil11, el control de la presión arterial12, el desarrollo vascular13,14, el picor mecánico15 y el estado de hidratación de los eritrocitos16.

Los PIEZO son proteínas de membrana homotriméricas grandes dispuestas estructuralmente como un triskelion4,5,7 (Fig. 1a). Cada protómero hace contacto en los dominios del poro central y de la tapa cerca del extremo C y proyecta una hoja de 36 dominios transmembrana que se extiende hacia afuera y hacia arriba hacia el extremo N. Aunque solo se encuentran disponibles estructuras parciales de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de PIEZO1 que carecen de aproximadamente un tercio de las láminas distales, el homólogo estructural PIEZO2 se ha resuelto con el complemento completo de dominios transmembrana17. En predicciones y modelos estructurales, las palas tienen forma de cuenco de aproximadamente 24 nm de diámetro y 9 nm de profundidad, con un área total proyectada de aproximadamente 450 nm2. Las láminas se conectan directamente al poro a través de un haz intracelular, lo que sugiere que son palancas que cierran directamente el canal y sensores primarios de fuerza mecánica6.

a, Modelos estructurales de PIEZO1, vistos extracelularmente. Se muestra la estructura crio-EM más completa de PIEZO1 con el distal faltante de aproximadamente un tercio de la hoja resaltado (izquierda) y la predicción de la estructura AlphaFold II de PIEZO1 (derecha). El dominio extracelular C-terminal (CED) se elimina del modelo AlphaFold II debido a una mala predicción. Las etiquetas TCO*K en la posición 103 se muestran como estrellas magenta. Cada protómero está coloreado por separado. b, Segmentación de partículas PIEZO1 candidatas de localizaciones de iPALM. Una imagen representativa de contraste de interferencia diferencial de ×100 (de n = 5 células) de una célula HEK293 que expresa TCO*K 103 PIEZO1 marcada con tetrazina-Alexa Fluor 647 (AF647) (arriba a la izquierda; barra de escala, 10 µm). Una representación de 3 nm por píxel de las localizaciones de la membrana plasmática desde el recuadro magenta en la parte superior izquierda (barra de escala, 3 µm) (parte superior central). Localizaciones binarias de AF647 (puntos magenta) con moléculas PIEZO1 candidatas que cumplen con los requisitos del vecino más cercano resaltadas con cuadros cian (barra de escala, 3 µm) (arriba a la derecha). También se muestran representaciones representativas de 3 nm por píxel de moléculas PIEZO1 candidatas con triple etiqueta que cumplen con los requisitos mínimos de separación de interlocalización (barras de escala, 30 nm) (abajo). c, Superpartícula fusionada de localizaciones triméricas PIEZO1 identificadas con triple promoción de simetría, vista de arriba hacia abajo (n = 5 células fotografiadas, n = 726 moléculas y n = 8500 localizaciones). Las localizaciones se visualizaron con tamaño y color proporcionales a la densidad local (ver Métodos). d, Superpartícula con umbral para una densidad local de más de 0,5 × 10−5, el mínimo que abarca localizaciones dentro de una esfera de 60 nm (izquierda). Localizaciones asociadas con cada hoja aislada con k-medias agrupadas con k = 3 grupos (derecha). e, Gráfico de dispersión de las distancias entre palas promedio por localización entre cada localización dentro de un grupo de palas de la superpartícula en la parte cy todas las localizaciones en un grupo de palas vecino, coloreado por densidad local. En la posición 103, la distancia entre palas más probable es 25,4 ± 5,9 nm (media ± sd), en comparación con 19,2 nm calculados a partir del modelo AlphaFold II.

Datos fuente

Cuando se reconstituye en bicapas lipídicas artificiales, la forma no plana de PIEZO1 es lo suficientemente rígida como para doblar la membrana a su alrededor, formando una cúpula8,18. Sin embargo, esta cúpula también es intrínsecamente deformable, propiedad probablemente controlada por la flexibilidad de las palas. Las observaciones de la cúpula de la membrana en las vesículas lipídicas y los modelos matemáticos que las acompañan indican que en una bicapa lipídica plana sin tensión lateral ni fuerzas de compresión, PIEZO1 debería aplanarse en relación con el estado solubilizado en detergente4,8,18,19. Dicha deformación es impulsada por el costo energético para doblar la membrana, en la que la proteína PIEZO curvada y la bicapa lipídica plana están en un estado de equilibrio mecánico. Las fuerzas aplicadas externamente parecen deformar aún más la cúpula PIEZO, aplanándose cuando se golpean con un microscopio de fuerza atómica en una bicapa lipídica plana soportada8, y en una simulación de dinámica molecular de la expansión de la bicapa a través de la tensión lateral20. Una estructura crio-EM parcial de PIEZO1 resuelta de afuera hacia afuera en una vesícula lipídica de 10 nm también muestra deformación de la hoja y el haz bajo fuerzas de flexión muy altas21. En conjunto, estos datos respaldan el modelo de que las láminas son lo suficientemente flexibles como para doblarse ante la deformación de la membrana y probablemente transducir fuerza para cerrar el poro. Sin embargo, la complejidad y heterogeneidad de las membranas celulares han requerido que estos experimentos se realicen en sistemas altamente purificados, y los métodos para aplicar fuerza al canal carecen de relevancia fisiológica directa. El extenso promedio requerido para ensamblar modelos estructurales crio-EM tampoco logra en muchos casos resolver la amplitud potencial de los estados conformacionales, especialmente de dominios proteicos relativamente flexibles.

En este estudio, superamos estas limitaciones previas mediante el uso de imágenes de fluorescencia nanoscópicas para observar directamente los estados conformacionales de las láminas de canales PIEZO1 individuales en una membrana celular. Dos enfoques de imágenes nanoscópicas de súper resolución combinados con nuevos algoritmos de segmentación e identificación de partículas nos permitieron aislar y medir moléculas PIEZO1 individuales con una resolución nanométrica. Utilizando este enfoque, aplicamos estímulos a las células y examinamos cómo la expansión de la hoja se correlaciona con la activación e inhibición del canal. A través de estos experimentos, también comenzamos a descubrir el mecanismo básico de modulación de canales por el activador de molécula pequeña Yoda1 y el inhibidor GsMTx-4. En conjunto, nuestros resultados muestran cómo el entorno celular puede dar forma a la estructura de PIEZO1 y cómo la expansión de la hoja subyace a la activación del canal.

Las etiquetas de proteínas y las sondas de afinidad introducen errores en la microscopía de fluorescencia de superresolución, ya que el fluoróforo (o fluoróforos) y la ubicación de la etiqueta están físicamente desplazados22. Para minimizar este tipo de error espacial, etiquetamos cada subunidad de PIEZO1 con un único fluoróforo extracelular mediante expansión del código genético y química de clic. Se utilizó un par ortogonal de aminoacil-ARNt sintetasa y ARNt que reconoce el codón ámbar UAG23 para incorporar una lisina conjugada con trans-cicloocteno (TCO*K) en la posición del aminoácido 103 en PIEZO1 de ratón expresado heterólogamente en células HEK293. Aunque aproximadamente el último tercio de la hoja PIEZO1 no se ha resuelto mediante crio-EM4,5,7, la estructura de esta región ha sido predicha por AlphaFold II24 y el modelado de homología utilizando la estructura PIEZO217 (Fig. 1a y Datos ampliados Fig. 1a). El aminoácido 103 reside en el bucle extracelular más distal de PIEZO1 en relación con el poro, y estas posiciones están separadas por 19,2 nm en la estructura terciaria (Datos ampliados, figura 1b). Las células vivas que expresan TCO*K 103 PIEZO1 se marcaron con el sustrato de clic complementario tetrazina conjugado con Alexa Fluor 647 (Datos ampliados, Fig. 2a, b). Se confirmó que este bucle es extracelular (Datos extendidos, Fig. 2b), y determinamos que el etiquetado o el etiquetado con clic no compromete la función del canal (Datos extendidos, Fig. 3a-e). Después del etiquetado, las células se fijaron en una solución de reticulación isosmótica para evitar cambios en la morfología celular y se tomaron imágenes sin permeabilización para mantener intacta la membrana plasmática. En conjunto, nuestro sistema de etiquetado introduce un fluoróforo en la cadena de aminoácidos de PIEZO1 con un error de compensación físico de menos de 1 nm25 y captura el canal en un entorno celular nativo.

Para comparar la conformación en reposo de PIEZO1 en una membrana celular con modelos estructurales, primero tomamos imágenes de células marcadas con microscopía de localización de fotoactivación interferométrica 3D (iPALM)26, una técnica utilizada anteriormente para medir cambios conformacionales masivos en proteínas de membrana27. Las partículas PIEZO1 individuales con triple etiqueta localizadas en la membrana plasmática se identificaron y segmentaron utilizando un algoritmo personalizado (Fig. 1b y Datos ampliados, Fig. 4). Aquí se identificaron grupos de tres densidades de localización a partir de representaciones de densidad de probabilidad y se segmentaron como partículas individuales (ver Métodos). Como los errores de localización efectivos para cada posición de la molécula están cerca de la distancia entre palas predicha por las estructuras y están ofuscados por la deriva de la muestra adicional y el error de vibración, no pudimos resolver distancias entre palas significativas de partículas individuales. Para aumentar la relación señal-ruido y la resolución, utilizamos un algoritmo de fusión de partículas 3D sin plantilla para fusionar localizaciones de todos los canales identificados y generar una superpartícula de PIEZO1 con triple etiqueta (Fig. 1c). Con conocimiento previo de la estequiometría de subunidades, aplicamos una simetría triple durante la creación de la superpartícula, ya que el algoritmo de registro tiende a coincidir con regiones de localizaciones densas28,29 (Datos ampliados, Fig. 5a, b).

Las nubes de localización individuales en la superpartícula correspondiente a cada posición del fluoróforo no son esféricas. Las localizaciones de un emisor de fuente puntual relativamente rígido fotografiadas con resolución casi isotrópica y fusionadas con un método que tenga en cuenta la incertidumbre de localización anisotrópica deberían resolverse como una esfera, como se demuestra con las subunidades marcadas del complejo de poros nucleares28. Sin embargo, las nubes de localización de la pala PIEZO1 se alargaron aproximadamente tres veces (Fig. 1c, d). Nuestra hipótesis es que este alargamiento se debió a la superposición de estados conformacionales, posiblemente impulsados ​​por una flexibilidad considerable de la hoja distal. En relación con la instantánea promediada proporcionada en los modelos estructurales, esto plantea la interesante posibilidad de que las láminas de los canales individuales no sean conformacionalmente uniformes. Luego, aislamos las nubes de localización asociadas con cada una de las tres palas y calculamos la distancia promedio por pares a todas las localizaciones en las palas vecinas (Fig. 1d, e). En comparación con la distancia entre palas calculada a partir de la predicción de la estructura AlphaFold II, la distancia más probable medida desde PIEZO1 en una celda es 6,2 ± 5,9 nm más expandida (media ± sd) (Fig. 1e). Como el modelo estructural no tiene membrana, estos datos también sugieren que la membrana plasmática ejerce una tensión de flexión suficiente para expandir las láminas de PIEZO1 en reposo.

Probar estas dos hipótesis con mayor precisión requirió la observación directa de las posiciones de las cuchillas de moléculas individuales de PIEZO1. Para lograr esto, utilizamos MINFLUX, un método de microscopía de fluorescencia de súper resolución 3D capaz de lograr una verdadera resolución isotrópica con un error de localización de solo 5 a 6 nm30,31,32. Nuestro sistema estaba equipado con un sistema de estabilización de muestras 3D que bloquea activamente la posición de la muestra con un error de menos de 2 nm32, minimizando la incertidumbre por deriva y vibración. Preparamos células exactamente como para iPALM, tomamos imágenes de las células marcadas con MINFLUX e identificamos partículas marcadas triplemente con un algoritmo de agrupamiento e identificación 3D automatizado separado (Fig. 2a; ver Métodos). Las localizaciones sin procesar se separaron primero en grupos y luego cada grupo se ajustó individualmente con un modelo de mezcla gaussiana (GMM) 3D para determinar la posición central de cada fluoróforo y la incertidumbre posicional33 (Fig. 2b). Designamos trímeros PIEZO seleccionando grupos de tres posiciones de fluoróforo separadas espacialmente de cualquier otra posición de fluoróforo detectada por más de 100 nm. Para todos los grupos de localización, el error medio de localización de fluoróforos en x, y y z fue de 6,0, 5,6 y 5,4 nm, respectivamente (n = 5 células y n = 123 posiciones de fluoróforos; Fig. 2d), mucho menor que las distancias entre hojas calculadas ( Datos ampliados Fig. 1b).

a, imágenes MINFLUX e identificación del trímero PIEZO1. Exploración confocal representativa de × 100 (de n = 5 células) de una membrana celular HEK293 que expresa TCO*K 103 PIEZO1 marcado (barra de escala, 2 µm) (izquierda). El color representa la intensidad escalada en cada detector (650–685 nm (verde) y 685–720 nm (rojo)). Grupos de localizaciones sin procesar (trazas) representadas como esferas de 15 nm de la misma región (barra de escala, 2 µm) (centro). Representación ampliada (esferas de 3 nm) que muestra PIEZO1 con etiqueta simple (roja), etiqueta doble (amarillo) y etiqueta triple (verde) identificado por el algoritmo (barra de escala, 20 nm) (derecha). b, trímero PIEZO1 representativo. Localizaciones sin procesar (esferas de 3 nm) coloreadas por el grupo DBSCAN. Las posiciones centrales se determinaron mediante un ajuste GMM 3D (círculos blancos). c, superpartícula con umbral de Ostu con aplicación de simetría triple (n = 5 células y n = 41 moléculas). d, Histogramas del error de ajuste de GMM para cada posición del fluoróforo del trímero (n = 41 moléculas y n = 123 posiciones del fluoróforo). Ancho del contenedor = 1 nm. La línea discontinua negra indica un error de ajuste medio. e, distancias entre cuchillas de PIEZO1 en una membrana (círculos grises; n = 41 moléculas y n = 5 células), la estructura PIEZO2 (PDB ID: 6KG7) en la posición alineada más cercana y la predicción AlphaFold II (E2JF22) (arriba). También se muestra un esquema de PIEZO1 marcado en una membrana (abajo). f, Distancias entre cuchillas por PIEZO1 solubilizado con detergente (17,1 ± 4,0 nm; círculos naranjas; n = 7 moléculas), predicción AlphaFold II (círculo negro) y PIEZO1 en una membrana (círculos grises) (arriba). Prueba de Kolmogorov-Smirnov: *P = 0,0106 y D = 0,662. También se muestra un esquema del método de inmovilización de proteínas y compactación con cuchilla (abajo). g, distancias entre cuchillas en una celda expuesta a GsMTx-4 20 µM (20,7 ± 6,6 nm; círculos amarillos; n = 20 moléculas y n = 3 células), predicción AlphaFold II (círculo negro) y PIEZO1 en una membrana (círculos grises) (arriba). Prueba de Kolmogorov-Smirnov: *P = 0,0126 y D = 0,4341. También se muestra un esquema de compactación con cuchilla de GsMTx-4 (abajo). Todas las pruebas estadísticas son de dos colas. Los valores en e–g son media ± sd

Datos fuente

Creamos una superpartícula fusionada a partir de las posiciones centrales PIEZO1 TCO*K 103 obtenidas con MINFLUX y, al igual que la superpartícula iPALM, observamos nuevamente un alargamiento no esférico de las nubes de localización (Fig. 2c). La incertidumbre mínima de la posición del fluoróforo también nos permitió medir directamente distancias desde canales PIEZO individuales. La distancia promedio entre palas entre cada pala en la posición 103 es 25,1 ± 7,4 nm (media ± sd) (Fig. 2e), consistente con la distancia más probable medida con iPALM (Fig. 1e). Aunque esperábamos que las palas se expandieran hasta cierto punto dado el aplanamiento observado de la cúpula de membrana PIEZO1 en grandes vesículas lipídicas18,19, nos intrigó descubrir que, en comparación con el modelo estructural AlphaFold II sin membrana, las regiones distales de las palas de PIEZO1 se expande en promedio aproximadamente un 29% cuando se incrusta en una membrana celular. También observamos que la desviación estándar de las distancias entre palas es mayor que el error de localización experimental, lo que respalda la hipótesis de que la dispersión de las distancias está impulsada por la flexibilidad intrínseca de la pala. En conjunto, estos datos sugieren que las láminas de PIEZO1 se expanden significativamente en reposo, presumiblemente por la membrana plasmática, y que las regiones distales de las láminas son muy flexibles.

A continuación, probamos si la expansión de la hoja observada en una célula está mediada directamente por la membrana plasmática. Como las únicas estructuras resueltas existentes de PIEZO1 carecen del último tercio aproximadamente de la lámina distal, hasta ahora nos hemos basado en modelos estructurales para calcular el alcance relativo de la expansión de la lámina. Por lo tanto, medimos directamente la conformación del canal sin membrana y la comparamos con el modelo estructural AlphaFold II. Para hacer esto, expresamos, solubilizamos y purificamos la proteína PIEZO1 esencialmente como se describe para los estudios crio-EM4,5,7,17,21. Las hojas distales de PIEZO1 purificado se marcaron en la posición 103 y se inmovilizaron sobre una superficie de cepillo de polietilenglicol (PEG) para obtener imágenes MINFLUX en presencia de detergente (Fig. 2f, abajo). Los canales se separaron en promedio por más de 100 nm mediante injertos escasos de PEG funcionalizado con biotina, la distancia mínima de separación entre canales requerida por el algoritmo de segmentación. Observamos una disminución significativa en la distancia entre palas en relación con el estado celular en reposo (P = 0.0106, prueba de Kolmogorov-Smirnov) a 17.1 ± 4.0 nm (media ± sd), muy cerca de la distancia entre palas medida a partir de la predicción de la estructura (Fig. 2f, arriba). Estos datos confirman que el modelo estructural AlphaFold II es una comparación razonable sin membrana con nuestros datos. A medida que la eliminación de componentes celulares, incluida la membrana, compacta las láminas, estos datos sugieren nuevamente que la membrana plasmática expande significativamente las láminas en una célula. Estos experimentos también actúan como un control crítico para nuestro proceso de análisis de dos maneras clave: nuestras mediciones entre palas en detergente concuerdan con los modelos estructurales existentes, y observamos un gran cambio conformacional entre cada condición cuando los parámetros de imagen y segmentación se mantienen constantes.

La compactación observada de las láminas al eliminar la membrana plasmática y los componentes celulares plantea la posibilidad de que los inhibidores de la actividad del canal también puedan actuar mediante el mismo mecanismo. Algunos inhibidores de PIEZO1, como el gadolinio, la estreptomicina y el rojo de rutenio, evidentemente bloquean el flujo de iones a través del poro1,34, pero otros, como el modificador de activación GsMTx-4, no tienen un mecanismo de acción probado. GsMTx-4 es una toxina peptídica aislada de la tarántula rosa chilena que inhibe ampliamente los canales iónicos mecanosensibles35,36. La constante de unión de equilibrio Kd de GsMTx-4 a una bicapa lipídica y la concentración inhibidora media máxima (CI50) para PIEZO1 son aproximadamente 2 µM (refs. 36,37,38), lo que coincide con que la bicapa lipídica es el objetivo principal de acción. Además, las simulaciones de dinámica molecular sugieren que GsMTx-4 actúa como una reserva móvil de material de membrana al cambiar entre penetración poco profunda y profunda dependiendo de la tensión de la bicapa, actuando de hecho como un amortiguador que reduce la tensión local de la membrana37. El efecto neto sobre la actividad del canal PIEZO1 es un desplazamiento hacia la derecha de la curva de desplazamiento de corriente36, lo que requiere un estímulo mucho mayor para abrir el canal. Dados estos modelos y el pequeño tamaño de la toxina de 35 aminoácidos (aproximadamente 2 nm de diámetro; PDB ID: 1LU8), razonamos que podría incrustarse directamente en la cúpula de membrana formada por PIEZO1 y liberar la tensión de flexión local. que mantiene las cuchillas extendidas (Fig. 2g, abajo).

GsMTx-4 tiene una afinidad de membrana relativamente baja y una velocidad de salida rápida (koff ≈ 0,2 s-1) (ref. 37). Por lo tanto, para preservar mejor el estado conformacional inhibido transitoriamente, aplicamos GsMTx-4 durante 5 minutos a una concentración (20 µM) diez veces mayor que la concentración de unión de equilibrio y fijamos rápidamente las células (ver Métodos). Utilizando el mismo método de imágenes MINFLUX y algoritmo de segmentación que en experimentos anteriores, medimos la distancia entre palas de canales PIEZO1 individuales. En presencia de GsMTx-4, la distancia promedio entre palas fue de 20,7 ± 6,6 nm (media ± sd), que disminuye significativamente en relación con la condición de reposo celular (P = 0,0126, prueba de Kolmogorov-Smirnov), y muy cerca del detergente- Predicción del estado solubilizado y de la estructura libre de membrana (Fig. 2g, arriba). Estos datos indican que la liberación de la tensión de flexión de la membrana provoca la compactación de la hoja y proporciona un mecanismo básico de inhibición para GsMTx-4. Como GsMTx-4 parece actuar específicamente sobre la bicapa lipídica, estos datos también sugieren que la expansión de la lámina está mediada principalmente a través de la membrana plasmática en lugar de a través de la unión al citoesqueleto o la matriz extracelular39,40.

A continuación, nos centramos en hasta qué punto la aparente extensión de los estados conformacionales está impulsada por la flexibilidad de la hoja. Aunque la heterogeneidad observada en la expansión de la lámina podría deberse en parte a diferencias locales en las propiedades de la membrana, como la topografía y el módulo de flexión, la lámina larga de los dominios transmembrana debería comportarse aproximadamente como una varilla elástica flexible dentro de los límites de la membrana plasmática. Las deflexiones de la energía térmica aleatoria en los extremos distales deben ser mayores que cerca del centro del canal. De hecho, los modelos físicos predicen que al menos parte de PIEZO1 podría ser igualmente flexible como una bicapa lipídica, lo que implica que las fluctuaciones térmicas por sí solas pueden provocar deformaciones sustanciales de la forma de PIEZO1 (refs. 18, 19). Sin embargo, dada la gran distribución de estados conformacionales, nos preguntamos si ciertas características estructurales podrían ser responsables de estas propiedades mecánicas.

La rigidez de la estructura terciaria de una proteína está determinada predominantemente por la fuerza de las interacciones de aminoácidos en las interfaces de unión41,42. Cada hoja de PIEZO1 se puede dividir en nueve dominios de repetición PIEZO, y cada repetición forma un grupo de cuatro hélices transmembrana empaquetadas que contienen interfaces de unión entre repeticiones (Fig. 3a). Utilizando la estructura AlphaFold II de la hoja PIEZO1, calculamos la energía de unión repetida entre PIEZO (−∆G) para las interfaces de dominio43, con y sin la contribución de bucles intracelulares y extracelulares, incluidos los dominios que se espera que aumenten la fuerza de unión entre dominios, como la viga (Fig. 3b). Observamos una disminución dramática y gradual en −∆G a lo largo del eje proximal a distal de la hoja, consistente con las energías de unión del dominio repetido PIEZO2 calculadas directamente a partir de la estructura crio-EM. La baja energía de unión es especialmente evidente para la repetición distal I, que se une sólo a otra repetición PIEZO y está expuesta más extensamente a la membrana plasmática. La diferencia promedio de energía libre entre la repetición F (en el borde de las estructuras crio-EM PIEZO1 resueltas) y la repetición I (la repetición más distal) es de 28,6 kcal mol-1 (16,9 kBT). En un entorno complejo de membrana-agua, las energías de unión de la interfaz real probablemente sean diferentes, pero la tendencia general indica que las repeticiones proximales cercanas al dominio del poro son más rígidas que las repeticiones distales y menos susceptibles a la flexión de la membrana plasmática.

a, dominios de repetición PIEZO de PIEZO1 (izquierda; AlphaFold II E2JF22) y PIEZO2 (derecha; PDB ID: 6KG7), con posiciones etiquetadas. b, Energía de unión repetida entre PIEZO para PIEZO1 (azul; AlphaFold II E2JF22) y PIEZO2 (naranja; PDB ID: 6KG7) con la contribución de dominios transmembrana únicamente (TMD) o con contribución adicional de bucles ordenados. Las repeticiones etiquetadas se indican con flechas negras. c, Gráfico de dispersión de distancias promedio entre palas en la posición proximal de la pala 670 (17,8 ± 4,2 nm; círculos morados; n = 35 moléculas y n = 5 células) en comparación con la posición distal 103 (25,1 ± 7,4 nm; círculos grises; n = 41 moléculas y n = 5 células) medido con MINFLUX en una membrana celular. Prueba de Kolmogorov-Smirnov: ****P = 0,000087 y D = 0,5157. Las distancias se muestran como media ± sd d, varianza e intervalo de confianza del 95% de las distancias promedio entre palas en las posiciones 103 y 670 a partir de los datos del diagrama de dispersión en la parte c. Prueba F de igualdad de varianzas: P = 0,000535 y estadístico F = 3,10. e, histogramas del error de ajuste de GMM para todas las moléculas PIEZO1 marcadas triplemente identificadas en la posición 103 (gris; n = 123 posiciones de fluoróforo) y la posición 670 (púrpura; n = 105 posiciones de fluoróforo). Ancho del contenedor = 1 nm. Diferencia en el error de ajuste mediano de GMM Δσ x = 0,66 nm, Δσ y = 0,59 nm y Δσ z = 0,69 nm. f, Histogramas de ángulos entre palas para moléculas PIEZO1 marcadas triplemente identificadas agrupadas por 10 nm y ajustadas con un gaussiano en la posición 103 (56,4 ± 27,8 nm; R2 = 0,84) (arriba) y la posición 670 (58,2 ± 18,5 nm; R2 = 0,94 ) (medio). Los valores se muestran como media ± sd. También se muestra un diagrama de dispersión del cambio en los ángulos entre palas desde simétrico (60°) para las posiciones 103 y 670 (abajo). Prueba de Mann-Whitney: **P = 0,0059, U = 5090. Las barras de error se muestran como mediana e intervalo de confianza del 95 %. Todas las pruebas estadísticas son de dos colas.

Datos fuente

Para medir la flexibilidad en dominios de cuchilla más proximales dentro de estructuras crio-EM resueltas, etiquetamos PIEZO1 con TCO*K en el aminoácido 670, que se encuentra en un bucle extracelular de repetición F (Datos ampliados, figuras 1b y 2b). Cuando medimos y analizamos con nuestra tubería MINFLUX, observamos una disminución estadísticamente significativa en las distancias entre palas en relación con la repetición I (P = 0,000087, prueba de Kolmogorov-Smirnov) (Fig. 3c). Es de destacar que la variación de las distancias promedio entre palas disminuyó significativamente entre las posiciones 103 y 670 (Fig. 3d), lo que indica que se está ocupando un rango menor de estados conformacionales en la repetición F y que hay una gran diferencia en la flexibilidad. Los errores de ajuste de GMM para cada condición son casi los mismos (cambio en la mediana del error de ajuste de GMM (Δσ) x = 0,66 nm, Δσ y = 0,59 nm y Δσ z = 0,69 nm; Fig. 3e), por lo que no son responsables de la diferencia aparente en propiedades mecánicas. De acuerdo con la disminución de la flexibilidad, el ángulo entre las tres posiciones del fluoróforo en cada molécula PIEZO1 identificada en la repetición F fue significativamente más simétrico que en la repetición I (Fig. 3f). Sospechamos que tales diferencias en la flexibilidad son la razón por la que la cuchilla distal aún no se ha resuelto mediante crio-EM.

A continuación, examinamos el grado relativo en el que la membrana plasmática expande cada sección de la cuchilla. En comparación con las estructuras y predicciones sin membrana, la hoja en la repetición proximal F se expande solo 2,4 ± 4,2 nm, en comparación con 5,9 ± 7,4 nm en la repetición distal I (media ± sd) (Fig. 3c). Este aumento promedio de más del doble es consistente con la gran diferencia en la estabilidad energética de estos dominios y la consiguiente diferencia en flexibilidad. La distancia promedio entre las hojas de la posición 670 en una célula se encuentra entre la de la estructura solubilizada en detergente, presumiblemente libre de estrés, y la estructura crio-EM aplanada y altamente tensa de PIEZO1 resuelta de afuera hacia afuera en vesículas lipídicas de 10 nm21, lo que proporciona evidencia adicional. que hemos capturado un estado de reposo de expansión de la lámina por la membrana plasmática.

Luego preguntamos si podíamos medir los cambios inducidos en la flexibilidad de la hoja en una sola posición etiquetada. Para hacer esto, alteramos la rigidez de la membrana cambiando la composición lipídica de la membrana plasmática. Los ácidos grasos saturados, como el ácido margárico, aumentan la rigidez y la viscosidad de la membrana44 y, en consecuencia, deberían disminuir la magnitud del desplazamiento de la cuchilla por movimiento térmico aleatorio. Enriquecimos la membrana plasmática de las células que expresan PIEZO1 con ácido margárico 300 µM, tomamos imágenes con MINFLUX, y descubrimos que las láminas distales tenían una variación significativamente menor de las distancias entre las láminas, lo que coincide con una disminución aparente en la magnitud de las fluctuaciones de las láminas (Datos ampliados, figura 6b). ). Estos datos respaldan aún más la observación de que la extensión de los estados conformacionales en la hoja distal está impulsada por la flexibilidad intrínseca de la hoja. No observamos cambios significativos en la distancia entre hojas con el enriquecimiento con ácido margárico (Datos ampliados, Fig. 6a). El modelado matemático de PIEZO1 en la membrana plasmática predice que una mayor rigidez de la membrana también debería expandir las láminas y disminuir el umbral aparente de activación del canal4; sin embargo, los datos electrofisiológicos indican por el contrario que el ácido margárico aumenta el umbral de activación45. Estos datos sugieren que la influencia de la composición de la membrana en la conformación de PIEZO1 probablemente tenga más matices de lo previsto a partir del modelado solo y puede implicar modulación y unión directa a proteínas.

GsMTx-4 inhibe la actividad del canal PIEZO y nuestros datos sugieren que compacta las láminas de PIEZO1 liberando la tensión de flexión de la membrana. Por el contrario, la aplicación de fuerza a una membrana celular activa PIEZO1 (refs. 1,2), presumiblemente a través de la tensión de la membrana lateral y la deformación de la cúpula de la membrana4. Por tanto, nos centramos en hasta qué punto las láminas se expanden cuando se estira la membrana plasmática. Buscamos un estímulo compatible con las imágenes MINFLUX que expanda uniformemente la membrana y active directamente PIEZO1.

Un ambiente extracelular hipotónico aumenta el volumen celular mediante inflamación osmótica. Dada una superficie finita, la hinchazón aplica tensión a la membrana plasmática46. La inflamación osmótica también induce la entrada de Ca2+ a través de PIEZO1 (ref. 47), pero no encontramos evidencia electrofisiológica de que active directamente el canal en condiciones normales. Las corrientes PIEZO1 evocadas mecánicamente se inactivan rápidamente (τinactivación = 10–30 ms) en potenciales de membrana negativos1, mientras que la tasa de inflamación osmótica en las células HEK293 es lenta y alcanza el volumen máximo en aproximadamente 2,5 minutos (ref. 48). Por lo tanto, sospechamos que la inactivación rápida oscurece la activación del canal en respuesta a la inflamación osmótica. La inflamación osmótica también provoca una corriente de cloruro de salida a través del omnipresente canal aniónico SWELL1 regulado por volumen (refs. 49,50), enmascarando aún más las corrientes evocadas por PIEZO1. Evitamos ambos problemas midiendo la activación de PIEZO1 inducida osmóticamente en células HEK293 con desactivación de Swell1 con abrazadera de voltaje de celda completa a +80 mV en la que la inactivación τ es aproximadamente diez veces más lenta que los potenciales de retención negativos en los que normalmente se registran las corrientes PIEZO. simular condiciones fisiológicas51. Observamos grandes corrientes dependientes de PIEZO1 que siguieron el curso temporal de la inflamación celular (Fig. 4a), lo que sugiere que el estiramiento de la membrana debido a la inflamación osmótica puede activar directamente PIEZO1.

a, Electrofisiología representativa de células enteras a +80 mV en respuesta a una solución extracelular hipotónica de células HEK293F knockout para Swell1 transfectadas con PIEZO1 y un control no transfectado. b, Expansión de la lámina en la posición 103 por hinchazón osmótica (34,7 ± 8,8 nm; círculos rojos; n = 14 moléculas y n = 4 células) en comparación con una célula no estimulada (25,7 ± 8,6 nm; círculos grises; n = 44 moléculas y n = 5 celdas). Prueba de Kolmogorov-Smirnov: *P = 0,0169 y D = 0,474. c, Cambio en el área proyectada calculada a partir del circunradio utilizando las distancias en la parte b de la inflamación osmótica (1651 ± 770 nm2; círculos rojos), una célula no estimulada (999 ± 726 nm2; círculos grises) y la predicción AlphaFold II (411 nm2; círculo negro ). Prueba de Kolmogorov-Smirnov: *P = 0,0264 y D = 0,4513. d, Electrofisiología representativa de células completas a +80 mV en respuesta a Yoda1 50 µM de células HEK293F knockout para Swell1 transfectadas con PIEZO1 y un control no transfectado. También se muestra la estructura química de Yoda1 (arriba a la izquierda). e, corrientes máximas de células enteras provenientes de la inflamación osmótica y Yoda1 (n = 5 células cada una (120 mOsm) y n = 3 células cada una (Yoda1)). Los valores se muestran como media ± sem f, distancias entre cuchillas en la posición 103 con Yoda1 50 µM (27,07 ± 6,60 nm; círculos gris oscuro; n = 69 moléculas y n = 3 células) y la condición no estimulada (25,13 ± 7,39 nm; gris claro círculos; n = 41 moléculas y n = 5 células) (prueba de Kolmogorov-Smirnov: P = 0,4712 y D = 0,1668), y en la posición 670 con Yoda1 50 µM (19,71 ± 3,01 nm; círculos de color púrpura oscuro; n = 22 moléculas y n = 5 células) y la condición no estimulada (17,77 ± 4,19 nm; círculos de color violeta claro; n = 35 moléculas y n = 5 células) (prueba de Kolmogorov-Smirnov: *P = 0,0481 y D = 0,3714). Se utilizan dos cifras significativas para resaltar la precisión. NS, no significativo. g, Resumen de resultados. Los valores en b,c,f se muestran como media ± sd. Todas las pruebas estadísticas son de dos colas.

Datos fuente

A continuación, expusimos células que expresaban TCO*K 103 PIEZO1 marcadas con fluorescencia a una solución hipotónica durante 2,5 minutos e inmediatamente fijamos las células en un fijador hipotónico en el pico de inflamación celular para preservar el estado activado. Cuando se midieron con MINFLUX, las distancias promedio entre cuchillas aumentaron significativamente de 25,7 ± 8,6 nm en estado de reposo a 34,7 ± 8,8 nm en estado hinchado (media ± sd; P = 0,0169, prueba de Kolmogorov-Smirnov), casi el doble en promedio como el grado de expansión de la hoja en reposo debido únicamente a la tensión de flexión de la membrana (Fig. 4b). Esta expansión se correspondió con un aumento significativo en el área total proyectada del canal en relación tanto con los modelos estructurales sin membrana como con el estado de expansión en reposo (Fig. 4c), lo que indica que la cúpula PIEZO1 se está aplanando en respuesta a este tipo de membrana. estirar. Estos resultados demuestran que el estiramiento de la membrana debido a la hinchazón osmótica suficiente para activar el canal también estira las láminas de PIEZO1.

También probamos el agonista de molécula pequeña Yoda1, que, al igual que la inflamación celular inducida osmóticamente, provoca una entrada robusta de Ca2+ dependiente de PIEZO1 en las células52. Yoda1 reduce la velocidad de inactivación del canal (Datos extendidos, Fig. 3d, e) y aumenta significativamente la probabilidad de apertura del canal en ausencia de fuerza aplicada52. Se desconoce el mecanismo exacto por el cual Yoda1 agoniza a PIEZO1, pero las simulaciones de dinámica molecular y la mutagénesis sugieren que se une en un bolsillo entre las repeticiones A y B53 de PIEZO1. Para comparar el alcance relativo de la activación del canal con la inflamación osmótica, medimos las corrientes de células enteras provocadas por Yoda1 50 µM aplicado en baño a células HEK293 knockout Swell1 mantenidas en un potencial de membrana positivo (Fig. 4d). También observamos corrientes grandes (más de 1 nA) de Yoda1 perfundido en baño sin estimulación mecánica, lo que sugiere que estos dos estímulos distintos activan vigorosamente PIEZO1 (Fig. 4e).

A continuación, medimos los cambios inducidos por Yoda1 en las distancias entre palas de PIEZO1 en la posición 103 con MINFLUX. Cuando las células se incubaron y se fijaron en presencia de Yoda1 50 µM, la distancia promedio entre hojas aumentó en promedio 1,95 nm (P = 0,4712, prueba de Kolmogorov-Smirnov; Fig. 4f). Dada la amplia variedad de estados conformacionales a partir de la flexibilidad del dominio, no observamos un cambio estadísticamente significativo en la distancia en esta posición. Por lo tanto, también medimos el movimiento de la hoja inducido por Yoda1 en la posición 670, una ubicación más rígida dentro de la hoja que ocupa un rango más pequeño de estados conformacionales (Fig. 3). Aquí observamos un cambio estadísticamente significativo en la distancia promedio entre palas de 1,94 nm en promedio (P = 0,0481, prueba de Kolmogorov-Smirnov), que es notablemente cercano en promedio en comparación con el cambio en la distancia inducido por Yoda1 en la posición 103 (Fig. 4f) . Estos datos indican que Yoda1 expande directamente las cuchillas, induciendo un pequeño movimiento conformacional estereotipado al unirse. Estos datos también resaltan el poder de nuestra técnica para observar con precisión movimientos moleculares a escala nanométrica.

En este estudio, hemos demostrado cómo el entorno celular puede dar forma a la conformación de PIEZO1 utilizando imágenes de fluorescencia nanoscópica directa. En relación con las estructuras publicadas, las láminas de PIEZO1 se expanden significativamente por la membrana plasmática, lo que coincide con las predicciones cuantitativas de las propiedades elásticas de la cúpula de la membrana PIEZO4,8,18,19. Hemos demostrado que las láminas de PIEZO1 son muy flexibles, lo que probablemente tenga implicaciones importantes para las propiedades de transmisión de fuerza desde la membrana al dominio de los poros y puede explicar por qué los dominios distales de PIEZO1 no se han resuelto mediante crio-EM. También hemos demostrado cómo la expansión de la pala mediante moduladores químicos y mecánicos se corresponde con la activación del canal. En conjunto, estos datos proporcionan una base para comprender cómo se activa PIEZO1 en un entorno celular (Fig. 4g).

En experimentos diseñados para medir la actividad de PIEZO1 en ausencia nominal de tensión, PIEZO1 está espontáneamente activo en una membrana celular (probabilidad de apertura en reposo Popen ≈ 0,5%)54,55, y la aplicación de GsMTx-4 parece inhibir esta actividad espontánea36. Hemos demostrado que tanto la aplicación de GsMTx-4 como la eliminación de la membrana con detergente contraen las láminas de PIEZO1 en relación con el estado de reposo celular. Estos datos sugieren que los modelos estructurales sin membrana representan un estado en el que Popen es presumiblemente cero y la conformación general está en su forma de energía más baja. También hemos demostrado que la membrana plasmática actúa directamente para expandir las láminas de PIEZO1 en reposo, de acuerdo con modelos físicos anteriores4,18,19. El alcance de esta expansión mediada por membrana es excepcionalmente grande, una propiedad conferida por la alta flexibilidad de la pala. Una consecuencia importante de la baja rigidez es que se requiere menos fuerza externa para aplanar y cerrar el canal. Esto no solo confiere una alta sensibilidad a la tensión de la membrana4,18,19 sino que también podría permitir que PIEZO1 muestree con mayor frecuencia un estado abierto sin fuerza externa. Al igual que la tensión en reposo de los enlaces de las puntas ejercida sobre el complejo del canal de transducción de células ciliadas del oído interno56,57,58,59, una gran expansión de la hoja en reposo permitida por dominios de hoja flexibles puede ser un mecanismo básico para mantener el canal en un estado de respuesta y conferirle un rango específico de sensibilidad a la tensión.

Sugerimos que las hojas pueden no ser uniformemente flexibles, una propiedad que podría impartirse mediante una fuerza de unión variable entre dominios (Fig. 3b). Estos cálculos tienen implicaciones importantes para la estructura y función general de la cúpula de la membrana, la estructura colectiva de la membrana plasmática y la proteína PIEZO4. Los cambios graduales en la distensibilidad hacia los extremos distales de las palas pueden permitir una transición mecánica suave entre el centro rígido del canal y la membrana plasmática relativamente flexible. El borde distal más flexible del domo PIEZO1 también puede permitir que el canal amortigüe el ruido mecánico de baja magnitud en una celda. Las porciones distales de las láminas parecen moverse relativamente independientemente entre sí dentro de un complejo de canales únicos, incluso en presencia de tensión de membrana (Datos ampliados, figura 7). Estos datos sugieren que las láminas distales no se mueven cooperativamente durante la entrada. Los estudios futuros podrían probar si y cómo la flexibilidad gradual de la hoja afecta la función de las proteínas al alterar la fuerza de unión entre dominios PIEZO con mutagénesis puntual o entrecruzamiento de doble cisteína, este último posiblemente permitiendo una manipulación aguda y reversible de las propiedades mecánicas.

La aparente correlación entre el grado de expansión de la pala y la actividad del canal demuestra la importancia del entorno de la membrana local para determinar las propiedades del canal. Por ejemplo, la alteración de la composición lipídica de la membrana puede modular las propiedades de activación e inactivación de PIEZO1 (ref. 45), y hemos demostrado que aumentar la rigidez de la membrana con el ácido graso saturado ácido margárico puede alterar las propiedades mecánicas de las palas (Datos ampliados, Fig. 6). La composición lipídica de los microdominios de la membrana o la topografía local de la membrana podrían modular directamente la probabilidad de apertura del canal en reposo a través de cambios conformacionales de la cuchilla y, en consecuencia, alterar la cantidad de fuerza requerida para abrir el poro. Tales características podrían ajustar las propiedades de respuesta mecánica del canal y pueden estar presentes en sitios especializados de mecanotransducción, como los complejos de células de Merkel-neuritas11,60. Por ejemplo, las características ultraestructurales, como las conexiones filamentosas entre las células epiteliales del folículo piloso y las terminaciones lanceoladas de los mecanorreceptores de umbral bajo61, pueden servir para modular la cantidad de tensión de flexión aplicada a las láminas de las proteínas PIEZO2, alterando quizás la actividad del canal para vincular las estructuras anatómicas particulares. propiedades de los mecanorreceptores a sus resultados funcionales distintivos.

Los datos descritos aquí muestran que la dinámica conformacional de proteínas de membrana individuales se ha observado con nanoscopía de fluorescencia directa a nivel de moléculas individuales. Aunque métodos como la FRET de una sola molécula pueden resolver posiciones relativas de fluoróforos en proteínas de membrana con precisión nanométrica dentro de la distancia espacial requerida para la transferencia de energía de resonancia62,63,64, nuestro enfoque informa posiciones absolutas sin un radio de acción restringido. Esperamos que estos métodos proporcionen una base para el uso de la nanoscopia de fluorescencia para la biología estructural de una sola molécula, especialmente para proteínas con dominios altamente flexibles o para aquellas refractarias para estudiar con los métodos actuales de microscopía electrónica. Una mayor eficiencia de etiquetado efectivo con métodos como DNA-PAINT65, una mayor señal a ruido con métodos de microscopía como MINSTED66 y una mayor capacidad para procesar conjuntos de datos de imágenes complejos con métodos computacionales más avanzados probablemente mejorarán nuestra capacidad para resolver la estructura de las proteínas incrustadas dentro del complejo. medio de una célula.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos ni a la evaluación de resultados.

La secuencia codificante de PIEZO1 de ratón (E2JF22, entrada UniprotKB) se optimizó con codones, se sintetizó y se clonó en el plásmido pcDNA3.1. Se insertó un codón de parada ámbar (TAG) en las posiciones de aminoácidos indicadas mediante mutagénesis dirigida al sitio con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs). La secuencia codificante de HaloTag se amplificó a partir del vector pHTC HaloTag CMV-neo (Promega) y la secuencia codificante de mEos3.2 se amplificó a partir del vector mEos3.2-ER-5 (Addgene). La secuencia codificante de Strep-Tag II se optimizó y sintetizó mediante codones (IDT). Las secuencias HaloTag y mEos3.2 se subclonaron por separado junto con Strep-Tag II en el plásmido mPiezo1-pcDNA3.1 con el kit NEBuilder HiFi DNA Assembly (New England Biolabs). La secuencia de cada plásmido se verificó mediante secuenciación del plásmido completo antes de su uso. Todas las secuencias de ADN se visualizaron y diseñaron en el software SnapGene (Dotmatics).

Las células se prepararon y etiquetaron de la misma manera para las imágenes iPALM y MINFLUX (Datos ampliados, figura 2). Se cultivaron células HEK293F (Expi293, Thermo Fisher) en medio de expresión Expi293 (Thermo Fisher) hasta una densidad de 1–2 x 106 células por ml. En todo momento, las células se mantuvieron a 37 °C con 8% de CO2 agitando a 125 rpm en un rotador con un diámetro de órbita de 19 mm. Se verificó que las células estaban libres de micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza). Antes de la transfección, las células se centrifugaron a 100 g durante 3 minutos, se intercambiaron en medio nuevo que contenía 250–500 µM de trans-ciclooct-2-en-l-lisina (isómero axial) (SiChem) y se transfirieron a un matraz de cultivo. Cada matraz se transfectó con una proporción de 1:1 de pNEU-hMbPylRS-4xU6M15 y una construcción de expresión PIEZO1 a una concentración total de 2 µg ml-1 utilizando PEI de 40 kDa (PolySciences) o reactivo de transfección EndoFectin Expi293 (GeneCopeia). Se permitió que las células transfectadas se expresaran durante 24 a 36 h. Luego, las células se sedimentaron dos veces de forma iterativa y se resuspendieron en medio Expi293 nuevo y se cultivaron durante 30 minutos para permitir que el exceso de TCO*K se difundiera de las células.

Para etiquetar las células, se trasladaron 1,5 x 106 células a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y el volumen se llevó hasta 1 ml con medio Expi293 nuevo que contenía una concentración final de reactivo de bloqueo al 1% p/v, ya sea BSA (Sigma) o Reactivo de bloqueo de Roche (Roche). Las células se mezclaron suavemente y se dejaron bloquear durante 3 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron a 100 g durante 2 minutos y se resuspendieron en medio Expi293 + reactivo de bloqueo al 1% p/v + tetrazina 4 µM-Alexa Fluor 647. Las células se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz y mezclando ocasionalmente de un extremo a otro. Para eliminar el exceso de fluoróforo, las células se sedimentaron y se lavaron tres veces en medio Expi293 + reactivo de bloqueo al 1%, y luego una vez en medio Expi293 sin reactivo de bloqueo. Durante los pasos de lavado, se tuvo mucho cuidado para ser lo más suave posible. Finalmente, las células se diluyeron a una concentración de 0,3 x 106 células por ml en medio Expi293 y se sembraron directamente sobre cubreobjetos.

Primero se prepararon cubreobjetos circulares de 25 mm de diámetro con fiduciales de oro de banda espectral ancha incrustados (600 ± 100 nm) bajo una capa de SiO2 de 50 nm (Hestzig) lavando con etanol al 100% y secando con una corriente de aire purificado. A continuación, las superficies de los cubreobjetos se volvieron hidrófilas mediante incubación con KOH 1 M durante 5 minutos. Los cubreobjetos se lavaron en agua MilliQ y se secaron nuevamente con una corriente de aire purificado. De las células marcadas a 0,3 x 106 células por ml en medio Expi293, se colocaron 400 µl en cubreobjetos y se dejaron adherir a la superficie del vidrio a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 15 minutos.

Después de adherir las células, se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) 1X precalentada a 37 °C sin Ca2+ o Mg2+ y se fijaron en HBSS 1X precalentado a 37 °C que contenía paraformaldehído al 0,8% (PFA) y 0,1 % glutaraldehído durante 10 min. Se tuvo especial cuidado al pipetear suavemente las soluciones en esta etapa, para no alterar mecánicamente las células. Las células se lavaron y se inactivaron en HBSS 1X que contenía Tris 50 mM (pH 7,4) durante 5 minutos y luego se lavaron extensamente en HBSS 1X.

El cubreobjetos se intercambió por un tampón de imágenes isotónico (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 10 mM, glucosa al 3,33%, cisteamina 100 mM, 40 µg ml-1 de catalasa de hígado bovino y 100 µg ml-1 de glucosa oxidasa de Aspergillus niger, tipo VII) mediante lavados sucesivos, y luego se cubrió con un cubreobjetos simple tratado con KOH de 25 mm y se selló con epoxi de 5 minutos (ITW Performance Polymers) y vaselina (Unilever). El cubreobjetos se montó en el microscopio como se describió anteriormente26. Las células se prepararon y se tomaron imágenes el mismo día.

En resumen, se aislaron 1 o 2 células en el campo de imágenes del microscopio iPALM y el instrumento se calibró utilizando fiduciales de oro incrustados como se describió anteriormente26. Las imágenes se realizaron con el software LabView personalizado como se describió anteriormente26. Para capturar el parpadeo de Alexa Fluor 647, se tomaron imágenes de muestras con una exposición de 30 ms y una excitación láser de 3 kW cm-2 de 640 nm para 60 000 fotogramas capturados con tres cámaras EMCCD (iXon 897, Andor). Aunque no se utilizó en el análisis de arquitectura posterior debido a la ineficiencia del etiquetado efectivo y al error de registro de la imagen, mEos3.2 etiquetado en el terminal C también se obtuvo imágenes con excitación láser de 561 nm y activación láser de 405 nm durante 20 000 a 120 000 fotogramas.

La reconstrucción de imágenes se realizó utilizando PeakSelector (G. Shtengel y H. Hess, Howard Hughes Medical Institute, https://github.com/gleb-shtengel/PeakSelector) como se describió anteriormente26. Se utilizaron nanopartículas de oro incrustadas en el cubreobjetos como marcadores fiduciales para calibrar, alinear y transformar marcos superpuestos en una única imagen 3D. Se filtraron de los datos las localizaciones con una incertidumbre x/y estimada de más de 0,06 píxeles (o equivalente nanométrico). Solo se incluyeron localizaciones que estaban a menos de 150 nm de los fiduciales del cubreobjetos para aislar las que se encuentran en la membrana plasmática o cerca de ella. Las localizaciones se exportaron desde PeakSelector como un archivo ASCII y los datos totales de localización sin procesar se exportaron como un archivo TIFF. Se utilizó el software MATLAB personalizado para eliminar localizaciones fiduciales de cuentas identificando cuentas en la imagen de datos sin procesar total y eliminando las localizaciones de cuentas correspondientes en el archivo ASCII (Datos extendidos, Fig. 4b).

Se representó una proyección Z sumada de localizaciones preprocesadas a 3 nm por píxel en PeakSelector usando configuraciones estándar y se guardó como un archivo TIFF. La imagen renderizada y un archivo ASCII que contenía localizaciones preprocesadas se cargaron en MATLAB y se identificaron y segmentaron moléculas PIEZO1 candidatas con triple etiqueta. En primer lugar, se encontraron picos en la imagen renderizada mediante el primer filtrado de paso de banda de los datos y el uso del algoritmo de Crocker y Grier67 para identificar los picos. A continuación, los picos se sometieron a un análisis del vecino más cercano, requiriendo que cada posición del fluoróforo tuviera dos vecinos, que sus posiciones centrales estuvieran separadas por más de 9 nm y menos de 60 nm, y que cada pico en el grupo estuviera a más de 60 nm de distancia de cualquier otro. localizaciones. Luego, cada molécula PIEZO1 candidata renderizada se conectó a las localizaciones correspondientes y las localizaciones se segmentaron en partículas individuales (Datos ampliados, figura 4c). Al utilizar una proyección Z sumada, este enfoque se limita a la segmentación en el plano x–y. Para eliminar localizaciones no asociadas en z, se eliminaron de cada partícula todas las localizaciones a más de 75 nm de distancia de la media de las partículas.

A continuación, Heydarian et al.28 introdujeron cada partícula segmentada en el flujo de trabajo de promedio de partícula única sin plantilla. En resumen, se utilizó el enfoque de barrido de escala para determinar un parámetro de escala óptimo de 5 nm para el proceso de registro total entre partículas segmentadas. Se utilizó un umbral de 1 para cinco iteraciones de la verificación de coherencia del álgebra de Lie, que se utilizó para formar una plantilla basada en datos y crear un conjunto inicial de partículas alineadas. Se agregó un paso de procesamiento adicional para rotar estas partículas alineadas inicialmente en el plano x–y antes de promover una simetría triple al rotar cada partícula inicialmente alineada mediante un factor entero aleatorio de 2 × π/3. Estas partículas promovidas por simetría se utilizaron luego para crear una superpartícula final en un paso de arranque, que comparó cada partícula con la plantilla basada en datos.

Las superpartículas (Fig. 1c, d y 2c y Datos extendidos Fig. 5) se visualizaron calculando una estimación de la densidad del núcleo para la superpartícula final, utilizando la función mvksdensity de MATLAB y un ancho de banda de 2,5 nm. Las localizaciones en la partícula se trazaron con tamaño y color proporcionales a su densidad local.

Se limpiaron cubreobjetos de vidrio redondos número 1,5 (Warner Instruments) de 18 mm de diámetro hirviendo en detergente Hellmanex III al 1% (Hellma GmbH) en agua MilliQ y sonicando durante 10 minutos en un baño de agua. Los cubreobjetos se lavaron cinco veces en agua MilliQ, se sonicaron en KOH 1 M durante 10 minutos y luego se lavaron nuevamente en agua MilliQ. Los cubreobjetos se cambiaron por etanol al 100 % y se almacenaron cubiertos a temperatura ambiente durante hasta 1 semana.

Antes de sembrar, los cubreobjetos se secaron con una corriente de aire purificado. De las 0,3 x 106 células por ml de suspensión celular en medio Expi293, se sembraron 207 µl en los cubreobjetos y se dejaron adherir a la superficie del vidrio a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 15 minutos. Las células se lavaron y fijaron como para las imágenes iPALM.

Para los experimentos de GsMTx-4, las células sembradas se lavaron en HBSS 1X y luego se incubaron con GsMTx-4 20 µM (Abcam) durante 5 minutos a temperatura ambiente. La solución se eliminó por completo y se añadió inmediatamente pero suavemente fijador (HBSS 1X precalentado a 37 °C que contenía 0,8 % de PFA y 0,1 % de glutaraldehído). Se dejó que las células se fijaran durante 10 minutos y se lavaron en HBSS.

Para el enriquecimiento de la membrana plasmática con ácido margárico, el enriquecimiento se realizó esencialmente como se describió anteriormente45. En resumen, se disolvió una ampolla nueva de ácido margárico (Nu-Chek Prep) a 150 mM en DMSO. Se añadió ácido margárico al medio Expi293 calentado a una concentración final de 300 µM. El medio se agitó alternativamente, se sonicó y se incubó a 37 °C hasta su completa disolución. Seis horas después de la transfección, el medio se cambió por el medio enriquecido con ácido margárico. Las células se cultivaron durante 18 h adicionales antes de la preparación para la obtención de imágenes.

Para los experimentos de Yoda1, se añadió una solución madre de Yoda1 10 mM (Tocris) en DMSO a HBSS 1x precalentado a 37 °C hasta una concentración final de 50 µM. La solución se agitó a máxima velocidad durante 45 s para disolver completamente el Yoda1. Las células se lavaron en HBSS 1X y se añadió inmediatamente Yoda1. Las células se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se eliminó la solución y se añadió inmediata pero suavemente fijador (precalentado a 37 °C 1 × HBSS que contenía 0,8 % de PFA y 0,1 % de glutaraldehído) que contenía Yoda1 50 µM. Se dejó que las células se fijaran durante 10 minutos y se lavaron en HBSS.

Para los experimentos de hinchamiento osmótico, las células sembradas se lavaron en HBSS 1X y luego se expusieron a una solución de Ringer modificada de 120 mOsm (NaCl 48,8 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM (pH 7,40) y d-glucosa 10 mM) durante 2,5 minutos. a temperatura ambiente. A continuación, las células se intercambiaron suavemente por un fijador hipotónico (Ringer modificado de 120 mOsm, PFA al 0,8% y glutaraldehído al 0,1%). Se dejó que las células se fijaran durante 10 minutos y se lavaron exhaustivamente en solución de Ringer modificada de 120 mOsm. Se determinó que la osmolalidad de todas las soluciones era ±5 mOsm con un osmómetro de presión de vapor.

Después de la fijación y el lavado, se aplicaron fiduciales de nanoesferas de oro de 150 nm (soluciones BBI) al cubreobjetos y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavó el cubreobjetos en HBSS.

Para obtener imágenes, las células se intercambiaron en el tampón de imágenes isotónico como para iPALM, excepto con cisteamina 20 mM. El cubreobjetos se colocó sobre un portaobjetos de vidrio que contenía un pocillo de cavidad (Globe Scientific) lleno con tampón de imágenes y se presionó hacia abajo para eliminar el exceso de tampón. Luego se selló el cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando epoxi dental Elite Double 22 (Zhermack).

Para obtener proteína PIEZO1 de ratón solubilizada con detergente, se transfectaron células Expi293 con mPIEZO1-N-tándem HisTag-TAG103-C-HaloTag-TwinStrep con pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 en un cultivo de 30 ml que contenía TCO*K 500 µM. Después de 12 a 16 h, las células se alimentaron con 7 ml de medio Expi293 y se añadió butirato de sodio hasta una concentración final de 5 mM. Después de 48 h, las células se sedimentaron y se resuspendieron en medio Expi293 nuevo y se cultivaron durante una hora adicional para permitir que el exceso de TCO*K se difundiera de las células. Luego, las células se lavaron peletizando a 100 gy resuspendiéndolas dos veces en 1x HBSS enfriado con hielo que contenía 1x inhibidor de proteasa HALT (Thermo Fisher). Las células se sedimentaron por última vez a 1000 g, se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Para purificar por afinidad la proteína, los sedimentos celulares congelados se resuspendieron directamente en un tampón de solubilización helado (HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, C12E9 al 1% y inhibidor de proteasa HALT 1x). La mezcla se giró de un extremo a otro a 4 °C durante 1 h para solubilizar las proteínas de la membrana y se centrifugó a 45.000 g durante 30 min a 4 °C para sedimentar residuos y agregados no solubles. El sobrenadante se cargó en una columna que contenía 1 ml de resina de afinidad metálica TALON sedimentada prelavada con tampón de lavado (HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, C12E9 al 0,1 % y 1 x inhibidor de proteasa HALT) y el PIEZO1 marcado con His. Se permitió que la proteína se uniera. Después de lavar la resina con 30 ml de tampón de lavado, se tapó la columna y se añadieron 300 µl de tampón de lavado que contenía tetrazina 4 µM-Alexa Fluor 647. El lecho de resina se resuspendió y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. La resina se lavó extensamente en tampón de lavado sin inhibidor de proteasa. La proteína se eluyó en HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, C12E9 al 0,1% e imidazol 200 mM. Luego, el eluato se cargó directamente en una columna que contenía 1 ml de resina de estreptactina-sefarosa prelavada con tampón de lavado. Después de la unión, la resina se lavó con 30 ml de tampón de lavado y se eluyó en tampón de lavado que contenía biotina 25 mM. El eluato se concentró en una columna de corte de peso molecular Amicon de 50 kDa a 5.000 gy se lavó dos veces con tampón de lavado. Finalmente, la proteína se intercambió con tampón utilizando dos columnas de desalinización Zeba de corte de peso molecular de 40 kDa preequilibradas con tampón de lavado. La concentración de proteína se cuantificó utilizando A280 en un Nanodrop (Thermo Fisher Scientific), se dividió en alícuotas, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Se adquirieron cubreobjetos de vidrio número 1,5 de 22 × 22 mm prefuncionalizados con un cepillo de PEG escasamente biotinilado (Microsurfaces). Dada la densidad del recubrimiento, la distancia promedio entre las biotinas en la superficie del cepillo es de aproximadamente 112 nm, que es aproximadamente la misma distancia de corte utilizada por el algoritmo de agrupamiento para identificar PIEZO con triple etiqueta. Todos los pasos fueron realizados a temperatura ambiente. Primero, los cubreobjetos se incubaron con fiduciales de nanoesferas de oro de 150 nm sin diluir (soluciones BBI) durante 20 minutos. Estas nanoesferas de oro se unieron escasamente a las imperfecciones de la superficie del cepillo de PEG, pero lo suficientemente densas como para que se pudieran encontrar al menos dos fiduciales de oro en un campo de visión para su estabilización en el microscopio MINFLUX. Luego, los cubreobjetos se lavaron bien con tampón de inmovilización (HEPES 25 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, DTT 2 mM, C12E9 al 0,1% y reactivo de bloqueo de Roche al 1%) y se incubaron en este tampón durante 15 minutos para bloquear los sitios no pasivados. A continuación, se diluyó Streptactina-XT no funcionalizada (IBA Lifesciences) a 100 nM en tampón de inmovilización, se añadió al cubreobjetos durante 7 minutos a temperatura ambiente para adherirse a las biotinas en el cepillo PEG, y los cubreobjetos se lavaron bien con tampón de inmovilización. para eliminar el exceso de Streptactina-XT. La proteína congelada instantáneamente se descongeló en hielo, se diluyó a 20 nM en tampón de inmovilización y se aplicó al cubreobjetos. Se permitió que PIEZO1 marcado con estreptococos se uniera durante 10 minutos a la Streptactina-XT inmovilizada y el cubreobjetos se lavó nuevamente a fondo en tampón de inmovilización. Luego, la proteína se intercambió y se lavó con tampón de inmovilización que contenía el detergente GDN sin reactivo de bloqueo de Roche (HEPES 25 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, DTT 2 mM y GDN 0,02%).

El cubreobjetos recubierto se colocó sobre un portaobjetos de vidrio que contenía un pocillo de cavidad (Globe Scientific) lleno con tampón de imágenes (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, glucosa al 10%, GDN al 0,02%, cisteamina 20 mM, 40 µg. ml-1 de catalasa de hígado bovino y 100 µg ml-1 de glucosa oxidasa de A. niger, tipo VII) y se presionan para eliminar el exceso de tampón. Luego se selló el cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando epoxi dental Elite Double 22 (Zhermack) y se montó en el microscopio MINFLUX. Las imágenes se realizaron como se describe anteriormente.

Todos los datos de MINFLUX se adquirieron en un microscopio 3D MINFLUX comercial utilizando el software Imspector con controladores MINFLUX (Abberior Instruments). Se eligió un campo de visión con tres o más fiduciales de oro para la estabilización. Se utilizó un sistema de estabilización activa que utiliza dispersión del infrarrojo cercano de fiduciales de oro y corrección de retroalimentación activa para fijar un punto de ajuste espacial elegido. Se aseguró que la desviación estándar media de la posición de la muestra medida en relación con el punto de ajuste de estabilización establecido por el software de interfaz MINFLUX fuera inferior a 3 nm en cada eje32. Se eligió un campo de visión de 25 a 225 µm2 en la parte inferior de la celda para las imágenes MINFLUX. Más del 50% de los fluoróforos visibles dentro del campo de visión fueron llevados a un estado oscuro mediante escaneos confocales iterativos con el láser de 640 nm a una potencia del 2 al 4%. Se tomaron imágenes de la muestra con una potencia de láser de 640 nm del 6 % y se aumentó manualmente hasta un 9 % durante el transcurso de la sesión de imágenes. Luego, la potencia del láser de 405 nm se aumentó lentamente de 0 a 12-18 % en el transcurso de varias horas. Se tomaron imágenes de las muestras durante un total de 12 a 48 h. Se tomaron imágenes de al menos tres réplicas biológicas y experimentales separadas para cada condición. Se midió que el láser de excitación de 640 nm tenía aproximadamente 4,30 µW por porcentaje de potencia establecida en el plano de muestra, y se midió que un láser de activación de 405 nm tenía aproximadamente 16 nW por porcentaje de potencia establecida en el plano de muestra. Tenga en cuenta que durante la rutina de orientación MINFLUX, la potencia del láser aumenta hasta un factor final de seis en la última iteración32.

Las localizaciones válidas finales sin procesar de las últimas iteraciones de orientación se exportaron directamente desde la interfaz de MINFLUX Imspector como un archivo .mat. Luego se utilizó el software de análisis MATLAB personalizado para identificar y segregar grupos de tres localizaciones. Para ser lo más consistente e imparcial posible, todos los datos se analizaron con los mismos parámetros, excepto por un caso especial (ver más abajo). Primero, los datos se filtraron para eliminar rastros con una desviación estándar de más de 10 nm y que contenían más de tres localizaciones por rastro. Este paso eliminó localizaciones del fondo y rayas grandes, que probablemente se debieron a moléculas fluorescentes en difusión que se movían a través del plano de imagen. A continuación, las localizaciones se sometieron a un algoritmo de agrupamiento basado en la densidad, esencialmente como se describió anteriormente33. Este algoritmo utiliza agrupación DBSCAN de dos pasos (dbscan2 en MATLAB) seguida de un GMM de maximización de expectativas para asignar localizaciones 3D a la posición de los fluoróforos. Aquí el primer paso de DBSCAN tenía una épsilon de 30 nm y requería cinco vecinos para un punto central (minpts = 5). El segundo paso de DBSCAN tuvo un épsilon de 6 a 7 nm, dependiendo de la cantidad de ruido en los datos, y minpts = 5. El ajuste sigma inicial del GMM se estableció en 5 nm. Las posiciones del centro del fluoróforo se estimaron como los valores medios del ajuste GMM.

Luego, cada posición de fluoróforo identificada se sometió a pasos separados de agrupamiento DBSCAN y de análisis del vecino más cercano. El paso DBSCAN identificó grupos de tres posiciones de fluoróforo con épsilon = 100 nm y minpts = 3. El paso vecino más cercano requería que cada posición de fluoróforo tuviera dos vecinos y sus posiciones centrales separadas entre 6 y 50 nm. En un caso especial, para la Fig. 4b, el paso vecino más cercano se ajustó para tener una distancia mínima y máxima de entre 5 y 60 nm, respectivamente, para capturar distancias entre cuchillas, que eran ligeramente superiores a 50 nm. Tenga en cuenta que la distancia entre palas más probable medida en la posición 103 en una celda es la misma que para la distancia máxima del vecino más cercano de 50 nm (Figs. 2e y 4b). A continuación, se segmentaron grupos de tres posiciones de fluoróforos que pasaron por ambos pasos. Los datos se filtraron manualmente en z según la distribución de localizaciones sin procesar para aislar solo moléculas PIEZO unidas a la membrana plasmática. Finalmente, los grupos candidatos que contenían ángulos entre palas de más de 120° se filtraron para eliminar rayas de rastros inespecíficas. Para cada grupo identificado de tres moléculas, la distancia promedio entre hojas se calculó directamente a partir de las posiciones centrales del fluoróforo.

Primero, las ubicaciones de las secuencias de los dominios de repetición PIEZO5 se aislaron de las secuencias de aminoácidos PIEZO1 (entrada Uniprot Q8CD54) y PIEZO2 (entrada Uniprot EJ2F22). Los dominios transmembrana se identificaron utilizando las estructuras como guía y se dividieron en cadenas distintas (Texto complementario). La energía de unión repetida entre PIEZO se calculó utilizando la herramienta PDBePISA43. La ganancia total de energía libre de solvatación tras la formación de la interfaz −ΔG se determinó para cada interfaz de unión que contacta cada dominio de repetición PIEZO con y sin la contribución de bucles extracelulares.

Los modelos estructurales de crio-EM se obtuvieron del Protein Data Bank (PDB), y los números de acceso del PDB se indican en el artículo. Para generar un modelo AlphaFold II trimérico, la predicción monomérica E2JF22 se superpuso a las tres subunidades PIEZO1 de PDB 6B3R. Debido a la falta de confianza en la colocación de la tapa en relación con las hojas PIEZO en el modelo AlphaFold, el CED se eliminó y no se incluyó en los análisis estructurales.

Las células se prepararon exactamente como para las imágenes MINFLUX, excepto que se añadió 1 µM del ligando Janelia Fluor 549-Halo (Promega) permeable a las células a la mezcla de etiquetado de tetrazina-Alexa Fluor 647. Todas las imágenes (Datos ampliados, Fig. 2b) se adquirieron en un microscopio confocal Nikon AX con el software NIS Elements y la configuración de la imagen (potencia del láser, ganancia, resolución, tiempo de permanencia de los píxeles, objetivo apocromático del plan de inmersión en aceite ×60 1,4 NA y configuración de las dimensiones de los píxeles). ) se mantuvieron iguales para todas las condiciones. Para todas las imágenes, los ajustes de brillo y contraste se aplicaron uniformemente a toda la imagen.

Para verificar la función adecuada de las proteínas marcadas, se transfectaron construcciones PIEZO1 sustituidas con TAG y pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 en una proporción de 1:1 en presencia de TCO*K 250 µM con Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) en Piezo1- células knockout HEK293 (CRL-3519, American Type Culture Collection) sembradas en cubreobjetos recubiertos de poli-d-lisina. Para experimentos de control de tipo salvaje, se cotransfectó mPIEZO1-IRES-eGFP (plásmido n.º 80925, Addgene) con pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 en una proporción de 1:1. Las células se cultivaron de acuerdo con las pautas de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo y se verificó que estaban libres de micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza). Se permitió que las células se expresaran durante 24 a 48 h antes de grabar.

Para los experimentos en los que se marcaron las células, las células se lavaron primero con DMEM y HEPES 20 mM. Todo el etiquetado se realizó a temperatura ambiente. A continuación, las células se bloquearon en DMEM, HEPES 20 mM y 1 mg ml-1 de reactivo de bloqueo de Roche durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las células se marcaron con DMEM, HEPES 20 mM, 1 mg ml-1 de reactivo de bloqueo de Roche y tetrazina-Alexa Fluor 647 4 µM durante 10 minutos. Luego, las células se lavaron en DMEM, HEPES 20 mM y 1 mg ml-1 de reactivo de bloqueo de Roche y se intercambiaron por DMEM y HEPES 20 mM. El etiquetado se confirmó mediante visualización en un microscopio de fluorescencia.

Las corrientes activadas mecánicamente de las células HEK293 Piezo1-knockout se registraron en modo de sujeción de voltaje de celda completa usando un amplificador MultiClamp700A y DigiData1550 (Molecular Devices) y se almacenaron directamente y digitalizaron en línea usando el software pClamp (versión 10.7). Las corrientes se registraron a −80 mV, se muestrearon a 20 kHz y se filtraron a 2 kHz. Los electrodos de registro tenían una resistencia de 1,5 a 3 MΩ cuando se llenaban con una solución intracelular a base de CsCl: CsCl 133 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM (pH 7,3 con CsOH), EGTA 5 mM, Mg-ATP 4 mM. y Na-GTP 0,4 mM. La solución del baño extracelular estaba compuesta por NaCl 133 mM, KCl 3 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM (pH 7,3 con NaOH) y glucosa 10 mM. La estimulación mecánica se logró utilizando una pipeta de vidrio pulida al fuego (con un diámetro de punta de 3 a 4 µm) colocada en un ángulo de 80° con respecto a la célula que se estaba registrando y a aproximadamente 5 µm de distancia de la célula. El desplazamiento de la sonda hacia la celda fue impulsado por una microetapa de cristal piezoeléctrico controlada por Clampex (controlador/amplificador E625 LVPZT, Physik Instrumente). La sonda tenía una velocidad de 1 µm ms-1 durante la fase de rampa del comando para el movimiento hacia adelante, y el estímulo se aplicó durante una duración de 125 ms. Para cada celda, se aplicó una serie de pasos mecánicos en incrementos de 1 µm cada 10 s comenzando con un desplazamiento inicial de 5 µm. El paso en el que la punta de la sonda tocó visiblemente la célula se utilizó como punto de referencia para determinar el umbral aparente (el micrómetro por encima de la célula en el que se observó la primera respuesta).

Se aplicó una familia de pasos de desplazamiento (incrementos de 0,5 µm) a la celda y las corrientes activadas mecánicamente se registraron generalmente entre 2 y 3 µm por encima del umbral de respuesta para evitar la pérdida de la celda. Yoda1 se diluyó a partir de una solución madre de 20 mM en DMSO, se agitó agresivamente y se usó en 5 minutos para evitar la precipitación en la solución. Se aplicó Yoda1 (10 µM) manualmente sin perfusión de baño y las células se expusieron durante 5 minutos seguido de lavado. Las familias de corrientes activadas mecánicamente se adquirieron dos veces antes de Yoda1, dos o tres veces en Yoda1 y varias veces durante el lavado.

Para Yoda1 y la electrofisiología hipotónica, se cultivaron células HEK293F desactivadas con Swell1 en medio FreeStyle 293 y se mantuvieron como para las células Expi293. Se verificó que las células estaban libres de micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza). Las células se transfectaron con mPIEZO1-IRES-eGFP (plásmido n.º 80925, Addgene) utilizando el reactivo de transfección EndoFectin 293 (GeneCopeia) a una concentración de 1 µg ml-1. Se permitió que las células se expresaran durante 48 h y se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-d-lisina antes de grabar.

Las corrientes de células completas se registraron utilizando un amplificador Axopatch 200B y Digidata 1440A (Molecular Devices) y se analizaron con pClamp (versión 10.2). Las corrientes se registraron a +80 mV, se muestrearon a 20 kHz y se filtraron a 2 kHz. Los electrodos de registro se extrajeron y pulieron hasta una resistencia inicial de 4 a 8 MΩ cuando se llenaron con una solución de pipeta que contenía lo siguiente: CsCl 110 mM, CsF 40 mM, EGTA 10 mM y HEPES 20 mM (pH 7,4).

Para los experimentos de Yoda1, la solución del baño contenía lo siguiente: NaCl 140 mM, KCl 2,4 mM, HEPES 10 mM (pH 7,4), d-glucosa 10 mM, MgCl2 4 mM y CaCl2 4 mM (307 ± 5 mOsm). Las respuestas se provocaron con Yoda1 50 µM preparado en solución de baño.

Para los experimentos de hinchamiento osmótico, la solución del baño contenía NaCl 40 mM, KCl 2,4 mM, HEPES 10 mM (pH 7,4), d-glucosa 10 mM, MgCl2 4 mM, CaCl2 4 mM y d-manitol 185 mM (310 mOsm ± 5 mOsm). ). Las respuestas se provocaron con una solución de baño hipotónica que contenía NaCl 40 mM, KCl 2,4 mM, HEPES 10 mM (pH 7,4), d-glucosa 10 mM, MgCl2 4 mM y CaCl2 4 mM (122 ± 5 mOsm). La osmolalidad de todas las soluciones se midió con un osmómetro de presión de vapor (Wescor).

Los datos se visualizaron y se realizaron pruebas estadísticas en el software MATLAB (MathWorks) y Prism (GraphPad). Las estructuras moleculares se visualizaron en el software MolStar Viewer (//molstar.org/viewer/) y Chimera (UCSF).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan el artículo, incluido el resultado del análisis MINFLUX sin procesar para cada condición experimental, se proporcionan como datos de origen. Las estructuras de proteínas se obtuvieron del RCSB Protein Data Bank (PIEZO1 6B3R, PIEZO1 7WLU y PIEZO2 6KG7) y de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold (PIEZO1 E2JF22). Los datos sin procesar y todos los reactivos que no están disponibles comercialmente están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código para el preprocesamiento de datos de iPALM se publicó anteriormente26 y está disponible en https://github.com/gleb-shtengel/PeakSelector. El código MATLAB personalizado para el análisis de datos de iPALM está disponible en https://doi.org/10.5281/zenodo.8017632. El código MATLAB personalizado para el análisis MINFLUX está disponible en https://github.com/PatapoutianLab/MINFLUX_Piezo_Analysis.

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Descargar referencias

Agradecemos a Y. Wang por la conceptualización preliminar, a C. Wurm, I. Jansen y Abberior Instruments por su ayuda con la adquisición de MINFLUX y la resolución de problemas de instrumentos y/o software; S. Khuon por su asistencia técnica con la preparación de muestras de iPALM; R. MacKinnon, C. Haselwandter y R. Hill por la lectura crítica del manuscrito; S. Hell y J. Keller por compartir el código de análisis de conglomerados; y miembros del laboratorio Patapoutian para comentarios y debates. Las imágenes MINFLUX se realizaron y contaron con el apoyo de Scripps Research Core Microscopy Facility. Las imágenes iPALM se realizaron y contaron con el apoyo del Centro de Imágenes Avanzadas del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes. El Centro de Imágenes Avanzadas del Campus de Investigación Janelia cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes y la Fundación Gordon y Betty Moore. Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01 HL143297. EMM cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación George E. Hewitt para la Investigación Médica. AP es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

kara marshall

Dirección actual: Departamento de Neurociencia, Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Instituto Médico Howard Hughes, Departamento de Neurociencia, Centro de Neurociencia Dorris, Scripps Research, La Jolla, CA, EE. UU.

Eric M. Mulhall, Anant Gharpure, Adrienne E. Dubin, Kara L. Marshall y Ardem Patapoutian

Centro de imágenes avanzadas, Campus de investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes, Ashburn, VA, EE. UU.

Rachel M. Lee, Jesse S. Aaron, Michael A. Reiche y Teng-Leong Chew

Departamento de Neurociencia, Centro de Neurociencia Dorris, Scripps Research, La Jolla, CA, EE. UU.

Kathryn Spencer

Departamento de Medicina Molecular, Scripps Research, La Jolla, CA, EE. UU.

Scott C.Henderson

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EMM diseñó y realizó todos los experimentos de biología e imágenes, analizó todos los datos, escribió el código de análisis MINFLUX, redactó el manuscrito y, junto con AP, concibió el proyecto. RML escribió el código de análisis de iPALM, analizó los datos de iPALM y realizó la fusión de superpartículas. AG y AED realizaron los experimentos de electrofisiología. EMM y AG realizaron los cálculos de energía de enlace. JSA y MAR ayudaron a preparar las muestras de iPALM y realizaron la adquisición de datos de iPALM. KLM, KRS y JSA preprocesaron y analizaron los datos de iPALM. SCH contribuyó a los experimentos de imágenes de MINFLUX y a la resolución de problemas. T.-LC y AP contribuyeron al diseño del proyecto. AP supervisó el proyecto. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron a la edición del manuscrito.

Correspondencia a Ardem Patapoutian.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Alistair Curd y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Representaciones moleculares a escala de estructuras crio-EM y modelos estructurales publicados. Cada protómero del trímero PIEZO es de color azul, naranja y verde. b, Arriba, distancias entre palas medidas entre la posición del aminoácido 103 en cada protómero de PIEZO1 para modelos que resuelven aproximadamente el último tercio de la pala distal. Se determinó que la posición de aminoácido equivalente más cercana para PIEZO2 era isoleucina 79. Abajo, se midieron las distancias entre las cuchillas entre la posición del aminoácido 670 en cada protómero de PIEZO1 de todas las estructuras que se muestran en a. Se determinó que la posición de aminoácido equivalente más cercana para PIEZO2 era la lisina 775. Los datos se presentan como valores medios ± sd. Para todos los cálculos, n = 1 estructura PDB.

Datos fuente

a, Descripción general del esquema de etiquetado y colocación de células utilizado para imágenes iPALM y MINFLUX. b, Las células que expresan construcciones mPIEZO1-C-HaloTag-TwinStrep sustituidas con TCO*K se marcaron en vivo con tetrazina-AF647 como para las imágenes iPALM y MINFLUX (Métodos). Se utilizó el JF549-HaloLigand permeable a las células para marcar el lado intracelular del canal. El etiquetado y etiquetado en las posiciones 103 y 670 dieron como resultado un etiquetado específico de la superficie celular de PIEZO1. El etiquetado en la posición 154 en un bucle intracelular en una ubicación que se sabe que no altera la función69 da como resultado la expresión de la proteína en la superficie celular como lo muestra el etiquetado JF549-HaloLigand, pero no el etiquetado con la tetrazina-AF647 impermeable a las células. Barra de escala = 20 µm. Imágenes representativas de n = 20 celdas.

a, Izquierda, esquema de electrofisiología de células completas con punción celular. Corrientes medias y máximas de células enteras provocadas por estimulación mecánica. Las células se transfectaron con mPIEZO1-IRES-eGFP (WT, círculos grises, −1189 ± 280 pA, n = 9 células), mPiezo1-TCO*K103-C-mEos3.2-TwinStrepTag (círculos azules, −1125 ± 262 pA, n = 11 células) y mPiezo1-TCO*K103-C-HaloTag-TwinStrepTag (círculos rojos, −1259 ± 986 pA, n = 7 células). Todas las células se cotransfectaron con ARNt/sintetasa y se cultivaron en presencia del aminoácido no natural TCO*K. Derecha, constante de tiempo de inactivación para corrientes máximas de células completas que se muestran en el medio (WT = 17 ± 3 ms, C-mEos3.2 = 14 ± 2 ms, C-HaloTag = 13 ± 2 ms). Todos los valores son medias ± sem b, corrientes celulares completas representativas provocadas por estimulación mecánica para mPIEZO1 marcado con TCO*K con y sin ARNt/sintetasa. c, Corrientes máximas de células completas provocadas por estimulación mecánica de células marcadas con tetrazina-AF647 usando las mismas condiciones que en a, para células cotransfectadas con ARNt/sintetasa y cultivadas en presencia del aminoácido no natural TCO*K. El etiquetado no produce un cambio significativo en la corriente máxima de toda la célula en relación con el canal WT (WT = −727 ± 362 pA, n = 4 células; C-mEos3.2 = −480 ± 128 pA, n = 6 células; C -HaloTag = −383 ± 108 pA, n = 11 células). Todos los valores son media ± sem d, desaceleración de la inactivación del canal inducida por Yoda1. La constante de tiempo de inactivación se midió antes, durante y después de la aplicación del baño de Yoda1 10 µM. Se muestran líneas que conectan mediciones de celdas individuales. e, Cuantificación de la desaceleración de la inactivación inducida por Yoda1 para cada una de las tres construcciones probadas. El cambio mediano en la inactivación se muestra como una línea negra (WT = 2,8, n = 3 células; C-mEos3.2 = 4,0, n = 3 células; C-HaloTag = 2,9, n = 4 células).

Datos fuente

a, Flujo de trabajo de procesamiento de datos iPALM, segmentación de partículas y fusión de superpartículas. b, Imágenes representativas (de n = 5 células) que muestran la eliminación de perlas y la segmentación PIEZO1 con triple etiqueta candidata en localizaciones preprocesadas recopiladas con el láser de 640 nm. Arriba a la izquierda, localizaciones preprocesadas encontradas en/cerca de la membrana plasmática representadas a 4 nm por píxel. Arriba en el centro, una imagen del total de datos de fotones sin procesar recopilados. Las cuentas fiduciales de oro son aparentes como puntos brillantes ya que emiten fotones constantemente en cada cuadro de imagen. Arriba a la derecha, cuentas de oro fiduciales identificadas (círculos magenta) mediante el algoritmo de eliminación de cuentas de la imagen de datos totales sin procesar. Abajo a la izquierda, datos brutos totales superpuestos con localizaciones que muestran la eliminación de localizaciones asociadas a cuentas. Abajo en el centro, una representación de 4 nm/píxel de localizaciones purgadas de fiduciales de perlas. Estas localizaciones están asociadas con la fluorescencia AF647. Abajo a la derecha, localizaciones binarias de AF647 con moléculas candidatas PIEZO1 que cumplen con los requisitos del vecino más cercano resaltadas con cuadros cian. Barras de escala = 20 µm. c, Las primeras 150 partículas PIEZO1 segmentadas con triple etiqueta identificadas a partir del algoritmo de segmentación que cumplen con los requisitos de distancia de separación de interlocalización y del vecino más cercano. Cada partícula se muestra en un cuadro delimitador cian de 40x40 nm. d, Descripción general de cada uno de los tres pasos principales del algoritmo de fusión de partículas de Heydarian y otros.28. e, El número total de localizaciones por partícula PIEZO1 triple etiquetada identificada de todos los conjuntos de datos de iPALM (n = 5 células con imágenes, n = 726 partículas identificadas, n = 8500 localizaciones totales). f, Una estimación de cuadrícula de densidad 2D de la superpartícula iPALM que se muestra en la Fig. 1c utilizando una cuadrícula agrupada de 1x1 nm y coloreada según la densidad local.

Datos fuente

a, izquierda, superpartícula iPALM con aplicación de simetría triple, basada en la estequiometría de canal conocida como se muestra en la Fig. 1c (n = 5 células fotografiadas, n = 726 partículas identificadas, n = 8500 localizaciones totales). Centro, k significa agrupación de posiciones de las palas como se muestra en la Fig. 1d. Derecha, diagrama de dispersión de las distancias promedio entre palas por localización como se muestra en la Fig. 1e. Se calculó que la distancia entre cuchillas más probable era 25,4 ± 5,9 nm, en comparación con 19,2 nm calculados a partir del modelo AlphaFold II en la posición 103. Las distancias se muestran como media ± sd b, izquierda, superpartícula iPALM sin simetría usando el mismo conjunto de datos como para (a). El número de localizaciones por posición de molécula no es uniforme. Dado que el algoritmo de registro tiende a coincidir con regiones de localizaciones densas, esto da como resultado un "punto caliente" de localizaciones28,29. Centro, k significa agrupación de las dos regiones de localizaciones más densas. La superpartícula de la derecha tuvo un umbral de densidad local de 2,75 × 10−5 antes de agruparse. Derecha, diagrama de dispersión de distancias promedio entre palas por localización. Se calculó que la distancia entre palas más probable era 25,0 ± 2,4 nm, en comparación con 19,2 nm calculadas a partir del modelo AlphaFold II en la posición 103. Las distancias se muestran como media ± sd

Datos fuente

a, Gráfico de dispersión de distancias entre láminas en la posición del aminoácido 103 con (círculos verdes, n = 30 moléculas, n = 3 células) y sin (círculos grises, n = 41 moléculas, n = 5 células) enriquecimiento de la membrana plasmática con ácido margárico 300 µM. Kolmogorov-Smirnov: P = 0,2030 y D = 0,2569. Las distancias se muestran como media ± sd b, varianza e intervalo de confianza del 95% de las distancias promedio entre palas en la posición 103 con y sin enriquecimiento con ácido margárico a partir de los datos del diagrama de dispersión en (a). Prueba F de igualdad de varianzas: P = 0,0012, estadístico F = 3,10). c, Error de ajuste del histograma del modelo de mezcla gaussiana para todas las moléculas PIEZO1 marcadas triplemente identificadas en la posición 103 con (verde) y sin enriquecimiento de ácido margárico (gris). Ancho del contenedor = 1 nm. d, Arriba, histogramas de ángulos entre hojas para canales PIEZO1 triplemente etiquetados identificados en la posición 103 sin enriquecimiento (56,4 ± 27,8 nm, R2 = 0,84) y con enriquecimiento con ácido margárico (57,1 ± 28,4 nm, R2 = 0,71). Los ángulos entre palas se agruparon en 10 nm y se ajustaron con un gaussiano. Los valores son media ± sd Abajo, diagrama de dispersión del cambio en los ángulos entre palas desde simétrico (60°). Mann-Whitney: P = 0,9097, U = 5484. Las barras de error se muestran como mediana e intervalo de confianza del 95%. Todas las pruebas estadísticas son de dos colas.

Datos fuente

Histogramas de distancias entre palas para cada borde del triángulo formado por las posiciones de los fluoróforos de moléculas PIEZO1 aisladas con triple etiqueta y las proporciones de cada uno de estos bordes. a, Distancias entre hojas y relaciones de borde para TCO * K 103 en ausencia de estímulo (de la Fig. 2e). b, Distancias entre hojas y relaciones de borde para TCO * K 103 con un estímulo de choque hipotónico de 120 mOsm (de la Fig. 4b). c, Distancias entre hojas y relaciones de borde para TCO * K 670 en ausencia de estímulo (de la Fig. 3c).

Datos fuente

Secuencias de proteínas PIEZO utilizadas para cálculos de energía de unión.

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Reimpresiones y permisos

Mulhall, EM, Gharpure, A., Lee, RM et al. Observación directa de los estados conformacionales de PIEZO1. Naturaleza 620, 1117-1125 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06427-4

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Recibido: 04 de febrero de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

Fecha de emisión: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06427-4

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