Un proceso de descubrimiento de anticuerpos biespecíficos de alto rendimiento

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 380 (2023) Citar este artículo

6033 Accesos

1 Citas

11 altmétrico

Detalles de métricas

Los anticuerpos biespecíficos (BsAb) representan una clase emergente de inmunoterapia, pero la ineficiencia del descubrimiento actual ha limitado su amplia disponibilidad clínica. Aquí presentamos un proceso de detección funcional unicelular, agnóstico y de alto rendimiento, que comprende ingeniería molecular y celular para la generación eficiente de células de la biblioteca BsAb, seguida de un interrogatorio funcional a nivel de una sola célula para identificar y clasificar clones positivos y secuencias posteriores. identificación y caracterización de funcionalidad. Utilizando un activador de células T biespecífico (BiTE) CD19xCD3 como modelo, demostramos que nuestra plataforma unicelular posee una eficiencia de detección de alto rendimiento de hasta un millón y medio de células de biblioteca variantes por ejecución y puede aislar clones funcionales raros a un precio bajo. abundancia del 0,008%. Utilizando una biblioteca celular compleja que expresa CD19xCD3 BiTE con aproximadamente 22.300 variantes únicas que comprenden scFv combinatoriamente variados, conectores de conexión y orientaciones VL/VH, hemos identificado 98 clones únicos, incluidos los extremadamente raros (abundancia de ~ 0,001%). También descubrimos BiTE que exhiben propiedades e ideas novedosas para diseñar preferencias variables de funcionalidad. Esperamos que nuestra plataforma unicelular no solo aumente la eficiencia del descubrimiento de nuevas inmunoterapias, sino que también permita identificar principios de diseño generalizables basados ​​en una comprensión profunda de las interrelaciones entre secuencia, estructura y función.

Los anticuerpos biespecíficos (BsAb) representan una clase muy atractiva de anticuerpos e inmunoterapéuticos que tienen un gran potencial para tratar muchos trastornos, incluidos el cáncer y la autoinmunidad1,2,3,4,5. Son productos biológicos no naturales que están diseñados para reconocer dos epítopos diferentes, ya sea en el mismo antígeno objetivo o en diferentes. Los BsAb ofrecen modos de acción terapéuticos únicos, como activar e involucrar a las células inmunitarias para matar las células tumorales y actuar simultáneamente sobre dos objetivos terapéuticos sinérgicos5,6,7,8. Por lo tanto, los BsAb pueden exhibir ventajas terapéuticas superiores sobre los anticuerpos monoclonales tradicionales (mAb) con respecto a especificidad, eficacia, toxicidad y resistencia a los medicamentos. Los BsAb activadores de células T (TAB) representan la subclase más grande de BsAb y representan más del 50 % de la cartera preclínica y clínica de BsAb9, incluidos Blinatumomab (CD3xCD19), Tebentafusp-tebn (CD3xGP100), Mosunetuzumab (CD3xCD20) y Teclistamab clínicamente aprobados ( CD3xBCMA)9,10. Los TAB pueden vincular directamente las células T y las células tumorales para matarlas y tienen un gran potencial para tratar muchos tipos de cáncer. Actualmente hay más de 45 TAB basados ​​en CD3, incluidos BCMAxCD3, Her2xCD3, CEAxCD3 y PSMAxCD3, que se están probando clínicamente para el tratamiento de cánceres sólidos y hematológicos1,6. Los TAB se pueden diseñar en varios formatos, incluidos los acopladores de células T biespecíficos (BiTE), que utilizan fragmentos variables de fragmentos monocatenarios unidos en tándem (scFv) que se dirigen a un epítopo de células T y a un antígeno tumoral, e IgG de cadena ligera común con un tamaño completo. configuración de inmunoglobulina donde cada cadena pesada variable se dirige a un receptor de células T o a un antígeno tumoral1,6.

Desafortunadamente, el desarrollo de BsAb terapéuticos, incluidos los TAB, sigue siendo un proceso extremadamente desafiante, lento y costoso, que limita su disponibilidad clínica para una amplia gama de enfermedades. Atribuimos este cuello de botella en gran medida a la complejidad e ineficiencia de los métodos actuales de descubrimiento de BsAb. El flujo de trabajo convencional para el descubrimiento de BsAb comúnmente comienza con la caracterización de un conjunto de aglutinantes de mAb para dos antígenos o epítopos respectivos. Luego se selecciona un panel de mAb para diseñar variantes de BsAb individualmente uniendo dos dominios de unión a antígeno derivados de cada mAb parental mediante heterodimerización de subunidades o fusión genética directa (p. ej., BiTE)11,12,13,14,15,16,17. 18,19,20,21,22,23. Luego se expresa, purifica y posteriormente se prueba individualmente un número limitado de variantes de BsAb en un ensayo de unión de doble objetivo y/o un ensayo funcional para identificar clones positivos. Es de destacar que, a pesar de que la construcción de BsAb generalmente comienza con dos aglutinantes de antígenos precaracterizados, integrarlos para convertirse en un BsAb funcional es mucho menos sencillo. De hecho, la actividad de unión de un BsAb a sus objetivos es sólo un requisito previo, que no siempre se traduce en actividad funcional. Por ejemplo, Emicizumab (un BsAb clínicamente aprobado para tratar la hemofilia A) se descubrió mediante un enfoque de "fuerza bruta" en el que aproximadamente 40.000 candidatos tuvieron que expresarse, caracterizarse y optimizarse individualmente11. Para los TAB, específicamente, las funciones de activación de células T y destrucción de tumores de los BsAb resultantes dependen crucialmente de numerosos factores, incluida la ubicación del epítopo y la distancia a la membrana celular24,25,26,27,28,29, el tamaño y la densidad del antígeno27,28,29 ,30,31,32,33,34,35,36, afinidad de unión anticuerpo/antígeno31,32,33,34,35,37,38 el tamaño, valencia, plegamiento, orientación estructural y mecánica de los BsAb, y la longitud del conector y flexibilidad27,36,39,40,41,42. Si bien es bien sabido que pequeñas variaciones en los formatos y características de los BsAb pueden ser determinantes críticos de la funcionalidad, las relaciones entre estos factores son complicadas y, actualmente, no existe un principio de diseño general que pueda informar la función de los BsAb. Por lo tanto, en la práctica, el campo se ha basado en un proceso de prueba y error en el que los BsAb se diseñan y construyen empíricamente a partir de aglutinantes de mAb existentes y luego deben evaluarse individualmente para determinar su funcionalidad. Este enfoque convencional, que normalmente implica una placa de microtitulación y un sistema de manipulación de líquidos, está sesgado y limita significativamente el rendimiento del descubrimiento de BsAb, la tasa de éxito y el tiempo de respuesta para identificar una pista terapéutica para un mayor desarrollo.

En este trabajo, describimos un proceso de detección funcional de BsAb unicelular de alto rendimiento (Fig. 1) que puede interrogar directamente las funciones de una gran cantidad de variantes de BsAb individuales de una biblioteca imparcial. La tubería unicelular integra varios módulos, incluido un módulo de ingeniería molecular y celular para la generación eficiente de bibliotecas de células con variantes de BsAb y células indicadoras, un módulo optoelectromecánico para la detección funcional unicelular basada en gotas para identificar y clasificar las células deseadas. Clones de BsAb y un módulo de validación y análisis molecular posterior para determinar las secuencias y la funcionalidad de los BsAb candidatos (Fig. 1). En esencia, la plataforma unicelular emplea un sistema basado en microfluidos de gotitas para compartimentar e interrogar células productoras de BsAb individuales con reporteros celulares coencapsulados. Los clones funcionales de BsAb podrán activar células indicadoras para producir fluorescencia, lo que permite detectar y clasificar gotitas "positivas" de una población heterogénea. Es de destacar que hemos implementado una innovadora química de ensayo ortogonal multiplexado, detección multipunto y una estrategia de indexación de gotas para garantizar la fidelidad de la detección. Utilizando un BiTE CD19xCD3 establecido como sistema modelo, describimos a continuación cómo se construye cada módulo en un flujo de trabajo optimizado. Hemos demostrado que nuestra plataforma unicelular puede acomodar un millón y medio de células de biblioteca en una sola ejecución, lo que representa un rendimiento de 2 a 3 órdenes de magnitud mayor que el de los métodos convencionales (decenas a cientos de clones para el manejo manual de placas de microtitulación). métodos o entre miles y decenas de miles de clones para sistemas robóticos de manipulación de líquidos). Utilizando una biblioteca enriquecida preparada con células HEK293 que expresan CD19 humano a un nivel comparable a las líneas celulares de linfoma y secreta un BiTE CD19xCD3 funcional, caracterizamos el rendimiento analítico, incluida la eficiencia de detección, y demostramos que la plataforma de células individuales es capaz de aislar ≥1 copias. de un clon funcional poco común (0,008 % de abundancia) con un 95 % de confianza en una sola ejecución. Usando una biblioteca BiTE CD19xCD3 compleja con aproximadamente 22,300 variantes únicas donde variamos combinatoriamente aglutinantes de scFv que abarcan diferentes epítopos y afinidades, orientaciones VL/VH y longitud y flexibilidad de los conectores de conexión de scFv, hemos identificado 98 clones funcionales únicos, incluidos clones extremadamente raros (~ 0,001% de abundancia) y clones que llevan enlaces peptídicos de conexión scFv rígidos que van en contra de la sabiduría convencional. El análisis de secuencia de clones clasificados cuestionó aún más las preferencias de diferentes variables de diseño para la funcionalidad y descubrió que las disposiciones CD19VL-VH-CD3VH-VL y CD19VH-VL-CD3VH-VL son la orientación más favorecida. El análisis de secuencia reveló además la composición de la secuencia del dominio CDRH3 con resolución de residuo único e identificó residuos de aminoácidos conservados o promiscuos para su función.

Los esquemas representan los diferentes pasos de la plataforma de microfluidos utilizada para el descubrimiento de BsAb, desde la preparación de muestras (células informadoras y células de biblioteca de BsAb), ensayo de gotitas y detección/clasificación seguido de PCR unicelular, secuenciación, expresión de proteínas y validación/caracterización funcional. de clones ordenados.

Los atributos estructurales y compositivos del diseño BsAb tienen un impacto significativo en sus funcionalidades. A diferencia del enfoque de prueba y error utilizado en los métodos convencionales, podemos realizar interrogatorios imparciales de muchas variables estructurales y de composición (p. ej., afinidad, ubicación del epítopo, diseño del conector y orientaciones relativas de los restos de anticuerpos de unión) de forma combinatoria sin conocimiento previo debido a el alto rendimiento de nuestra plataforma unicelular. En este estudio, buscamos desarrollar y validar la plataforma utilizando CD19xCD3 BiTE como modelo porque ha sido validada clínicamente y ampliamente estudiada (es decir, Blinatumomab) antes de expandir su utilidad a otros BsAb en el futuro. Los BiTE consisten en variables de fragmentos monocatenarios en tándem (scFv), con un scFv que se une a una subunidad del receptor de células T (más comúnmente CD3\(\varepsilon\)) y el otro a un antígeno diana (p. ej., un antígeno asociado a un tumor). (Figura 2a). Los dos scFv están unidos por un conector peptídico. Cada scFv comprende un dominio VH y un dominio VL derivados de aglutinantes de mAb, que están unidos por un conector peptídico corto. La interacción de las células T con las células tumorales en estrecha proximidad mediante BiTE activa las células T para que liberen citoquinas y factores apoptóticos (principalmente perforinas y granzimas) que posteriormente pueden matar las células tumorales.

a Variables de diseño interrogadas para los scFv CD19, los scFv CD3 y el conector peptídico que conecta los scFv. b Representación esquemática de la integración de la variante BiTE de copia única en la plataforma de aterrizaje que alberga la línea celular HEK293 (HEK293_LP) con el gen BiTE sin promotor que codifica la biblioteca de plásmidos del donante. c Representación de la diversidad de las características de diseño de BiTE obtenidas a partir de la secuenciación de amplicones de lectura larga (PacBio SMRT) de genes BiTE amplificados por PCR a partir de ADN genómico de células HEK293_LP integradas con BiTE, distribución de la orientación relativa de scFv (i), distribución de scFv CD3 relativos (ii ), Distribución de scFv CD19 (iii) y Distribución de enlazadores de interconexión scFv (iv). Se utilizaron ~22,300 secuencias BiTE únicas obtenidas de la secuenciación de amplicones de lectura larga para analizar la distribución de los parámetros de diseño (orientación relativa de scFv, tipo de scFv CD3, tipo de scFv CD19 y tipo de conector de interconexión scFv). La plantilla de ADN genómico utilizada para amplificar genes BiTE integrados se obtuvo de 3 × 106 células HEK_LPCD19/BiTE obtenidas de n = 1 experimento de integración.

El diseño de nuestra biblioteca incorpora múltiples variables, incluida la elección de scFv dirigidos a varios epítopos, afinidades de unión de scFv, longitud y flexibilidad de los conectores y orientación de los scFv, todos determinantes conocidos de la funcionalidad BiTE (Fig. 2a). Para los aglutinantes de CD19, elegimos secuencias scFv basadas en mAb 4G7, mAb FMC63, mAb B43 y mAb Juno241 (enumerados en la Tabla complementaria 1 con sus características). El mAb B43 es la base de Blinatumomab43,44. El mAb 4G7 y el mAb FMC63 se unen a un epítopo conformacionalmente similar en hCD19, pero distinto del epítopo de unión B4345. Mientras que 4G7 y B43 supuestamente tienen afinidades similares, FMC63 tiene al menos un orden de magnitud mayor de afinidad43,46,47,48. Se ha demostrado que Juno241 tiene una fuerte unión a CD1949. También adaptamos de manera similar cuatro aglutinantes de mAb CD3, OKT3, L2K, h38E4.v1 y TRX4 (enumerados en la Tabla complementaria 2 con sus características). L2K, por ejemplo, comparte más del 90% de identidad de secuencia con OKT3 y reconoce el mismo epítopo en CD3\(\varepsilon\) pero difiere en afinidad aproximadamente 100 veces50,51. L2K es la base de la molécula de Blinatumomab clínicamente aprobada43, mientras que OKT3 y TRX4 están disponibles comercialmente como formatos de mAb para el tratamiento de ciertas afecciones autoinmunes52. TRX4 y h38E4.v1 tienen una mayor afinidad por CD3 en comparación con OKT3 y L2K43,51,53,54. Para aumentar la diversidad de la biblioteca, realizamos una mutagénesis de exploración del sitio con codones degenerados NNW en la región CDRH3 de los candidatos scFv CD19 (ver Métodos). Para los conectores peptídicos que conectan los dos scFv, elegimos conectores cortos y largos flexibles basados ​​en el motivo GGGGS, así como conectores cortos y largos rígidos basados ​​en el motivo EAAAK (Tabla complementaria 3)55,56. La diversidad teórica de nuestra biblioteca combinatoria, calculada como el producto del número de variantes distintas de CD19 y CD3, el número de conectores de interconexión scFv y el número de diferentes orientaciones VL/VH, es 47,880 (Tabla complementaria 4). Luego se construye (a continuación) un sistema de expresión de BiTE basado en células de mamíferos que incorpora esta biblioteca diversa para preparar la biblioteca de células que expresan variantes de BsAb de entrada para el proceso de detección de células individuales.

Concebimos una estrategia de detección en la que las células T informadoras se encapsularán en gotitas con una única célula secretora de BiTE que también expresa el antígeno diana de interés, el CD19 humano, en la superficie a niveles comparables a las líneas celulares de linfoma comunes. Tener CD19 y BiTE expresados ​​en la misma célula, en lugar de en dos células diferentes, nos permite lograr una eficiencia de coencapsulación de gotitas adecuada con la célula informadora debido a la distribución de Poisson57. Esperamos que los BiTE funcionales secretados por las células que expresan CD19 entrecrucen la superficie celular CD19 y el complejo TCR-CD3 en las células indicadoras de células T y produzcan una señal indicadora intragotita ópticamente detectable. Para garantizar que podamos conectar la señal informadora intragotita (fenotipo) a una secuencia BiTE específica (genotipo), es crucial que solo se exprese un tipo de variante BiTE en cada célula que expresa CD19. Para lograr esto, buscamos desarrollar una plataforma de expresión de biblioteca de variantes BiTE basada en células de mamíferos (HEK293) donde cada célula de la biblioteca se integra genéticamente con un vehículo de expresión de plataforma de aterrizaje que codifica una única copia cada una para una variante de BsAb. Se eligió aquí HEK293 en parte debido a su facilidad de uso para la expresión a pequeña escala, así como a la producción a escala de proteínas recombinantes, incluidos los BsAb. Específicamente, adoptamos una línea parental de plataforma de aterrizaje HEK293 disponible comercialmente (“HEK293_LP”) que tiene un componente de “plataforma de aterrizaje” integrado en el genoma (es decir, un único sitio de unión de recombinasa-attP BxB1 en el locus de puerto seguro Hipp11 (H11). sobre el cromosoma 22 del genoma humano)58. La compatibilidad de esta línea de plataforma de aterrizaje HEK293 para la integración eficiente (hasta 38%) de un gen de interés exógeno se valida mediante la inserción del gen mCherry en el locus de la plataforma de aterrizaje (Figura complementaria 1a).

A continuación, preparamos una línea celular objetivo que expresa CD19 humano y un BiTE CD19xCD3 funcional. Primero integramos de manera estable un casete de expresión CD19 en un locus de puerto seguro en el cromosoma 1 usando CRISPR-Cas9 en la línea celular HEK293_LP59. Luego seleccionamos clonalmente HEK293_LP diseñados con CD19 para niveles de expresión de CD19 comparables a otras células CD19 + estándar, incluidas Raji, NALM-6 y SU-DHL-6 (Figura complementaria 1b). Por último, creamos una biblioteca de células que expresan BiTE con un tamaño y una diversidad que recapitulan los de los alelos y epítopos típicos de la línea germinal de anticuerpos para un objetivo determinado. Para esto, primero generamos un conjunto de bibliotecas de plásmidos "donantes" que albergaban variantes BiTE combinadas combinatoriamente aguas abajo de un sitio de unión "attB" (ver Métodos). Los elementos combinatorios para crear la biblioteca se analizaron en la sección anterior y en las Tablas complementarias 1 a 4. Luego, la biblioteca de plásmidos del donante que alberga BiTE se integró mediante recombinación mediada por integrasa en la plataforma de aterrizaje de las células HEK293_LPCD19 para obtener una biblioteca de células con expresión BiTE (HEK293_LPCD19/BiTE). En la Fig. 2b se ilustra un esquema de la integración del plásmido donante en el sitio de unión de la plataforma de aterrizaje. Después de la integración, la selección de antibióticos garantiza el enriquecimiento de células HEK_LPCD19/BiTE integradas con variante BiTE de copia única. El ADN genómico de las células integradas en BiTE se amplificó selectivamente por PCR con cebadores específicos del gen BiTE y los amplicones de PCR se analizaron mediante secuenciación de amplicones de lectura larga (PacBio, SMRT). Pudimos obtener ~22.300 variantes BiTE únicas y de longitud completa integradas en la biblioteca de células de mamíferos. Además, también confirmamos una representación bien distribuida de los parámetros de diseño, como clones scFv, enlazadores y orientaciones en las variantes BiTE integradas (Fig. 2c). También diseñamos una línea celular HEK293_LPCD19 integrada con Blinatumomab de una sola copia (HEK293_LPCD19/Blin) utilizando el mismo enfoque mediado por integrasa descrito anteriormente con un plásmido donante que contiene un casete de expresión de Blinatumomab BiTE que lleva las secuencias de aminoácidos idénticas a las del Blinatumomab aprobado por la FDA. incluyendo la misma etiqueta C-terminal 6XHis. Verificamos la expresión de Blinatumomab mediante citometría de flujo mediante tinción intracelular de las células diseñadas con un anticuerpo anti-etiqueta his (Figura complementaria 1c).

El núcleo de nuestra plataforma unicelular es el módulo optoelectromecánico para el ensayo unicelular basado en gotas (Fig. 1). Este módulo es capaz de realizar una encapsulación celular altamente eficiente, una incubación de gotitas celulares (fuera del chip en este estudio), una detección sensible y eficiente de células vivas intragotitas utilizando tubos fotomultiplicadores (PMT) y una clasificación de gotitas altamente eficiente mediante gotitas activadas por fluorescencia. clasificación mediante dielectroforesis (DEP). Es de destacar que nuestra plataforma unicelular emplea detecciones secuenciales multipunto innovadoras junto con indexación cinética de gotas, en donde la detección del segundo punto puede emplear un PMT o imágenes de gotas en serie usando una cámara para proporcionar resolución espacial. Hemos demostrado que las células objetivo y reporteras individuales se pueden coencapsular con una eficiencia adecuada de ~20% (debido a la distribución de Poisson57) en gotas de agua en aceite uniformes y estables utilizando un dispositivo de enfoque de flujo a un rendimiento de 1000 s. de gotas por segundo. El tamaño de las gotas (240 pL utilizados en este estudio), la composición del medio y las condiciones de incubación de las gotas se han ajustado para adaptarse a las células de uso común, incluidas Jurkat, HEK293 y células T primarias con ≥90% de viabilidad durante 9 horas (Figura 2 complementaria). ). Es de destacar que, según la densidad de los medios, las células objetivo y reporteras tienden a depositarse en el fondo de una gota esférica, donde luego estarían en contacto físico para facilitar las interacciones. Las partículas fluorescentes intragotitas (células o microperlas) se pueden detectar con aprox. 90% de eficiencia de detección (Figuras complementarias 3a, b), y las gotas positivas se pueden clasificar de manera eficiente incluso para clones de baja abundancia (<0,1%) con un rendimiento de clasificación de 100 a 1000 Hz. Por ejemplo, como demostración, la figura complementaria 3c mostró un enriquecimiento de clasificación eficiente de gotitas positivas de un grupo inicial de gotitas con un 10% de gotitas positivas que contenían ≥1 célula fluorescente. Las gotas clasificadas se pueden dispensar individualmente en placas de microtitulación para validaciones y análisis moleculares posteriores.

Una innovación clave de nuestra plataforma unicelular es la capacidad de detectar directamente funcionalidades que confieren modos de acción terapéuticos para evitar la necesidad de identificar primero los aglutinantes y luego evaluar sus funciones individuales como se requiere en los ensayos convencionales. Específicamente, para detectar BiTE funcionales basados ​​en la activación de células T, empleamos un sistema indicador de células T ("Jurkat-ZsG") derivado de la célula Jurkat (E6.1) que expresa la proteína fluorescente ZsGreen aguas abajo de la vía de activación de TCR impulsada por un promotor con factor nuclear 6 × de elementos transcripcionalmente sensibles (TRE) de células T activadas (NFAT) 60 para interrogar la interacción de células T/células tumorales mediada por BiTE y la activación de células T (Fig. 3a). Primero validamos funcionalmente Jurkat-ZsG en un ensayo de cocultivo con células Raji CD19 + en masa utilizando un BiTE recombinante con una secuencia idéntica a la de Blinatumomab y medios condicionados de nuestro HEK293_LPCD19/Blin diseñado (Figura complementaria 4a). Utilizando este ensayo en masa, validamos aún más nuestra biblioteca HEK293_LPCD19/BiTE que secreta clones BiTE CD19xCD3 funcionales utilizando sobrenadante purificado de células HEK293_LPCD19/BiTE (Figura complementaria 4b). La activación del indicador de células T mediada por Blinatumomab-BiTE mostró una alta eficiencia de activación (40%) con una tasa de falsos positivos del 1% y una cinética rápida (señal detectable en 3 h y máximo en 6 a 9 h) en gotas (Fig. 3b, c ). Estos datos respaldan que la interacción entre células T y células diana mediada por BiTE se puede analizar funcional y eficientemente en un formato de gotitas compartimentadas a nivel de una sola célula. De manera similar, hemos desarrollado y caracterizado un segundo sistema indicador Jurkat que expresa una proteína fluorescente de color rojo lejano E2-Crimson ("Jurkat-E2C") que se utilizó para mejorar la fidelidad de la detección de BiTE y reducir los falsos positivos. El umbral de la señal informadora para la clasificación generalmente se establece en (µnegativo + 4σ), donde µnegativo y σ, respectivamente, se refieren a la intensidad media de la señal y la desviación estándar en células informadoras no estimuladas. Es de destacar que las células indicadoras de Jurkat expresan muy poca o ninguna perforina (un factor apoptótico clave) tras la activación de las células T y, por lo tanto, no matan las células diana, que por lo tanto pueden recuperarse para análisis posteriores61.

a Mecanismo ilustrativo de la activación de células T mediada por BiTE CD19xCD3 en el ensayo de gotitas. Elemento responsivo RE. b Imágenes microscópicas de células indicadoras Jurkat-ZsG activadas (que expresan un indicador de GFP) en presencia de células Raji (CD19+) y un blinatumomab recombinante de grado de investigación en gotitas; barra de escala, 100 µm. Verde, señal del reportero ZsGreen; Rojo, un tinte de seguimiento celular preetiquetado para Raji. c Cambio de intensidad de la señal de ZsGreen en células Jurkat-ZsG añadidas con 100 ng / ml de Blinatumomab, sin células Raji (i) y con células Raji (ii) durante 0 a 9 h en puntos de tiempo posteriores a la incubación. La intensidad de ZsGreen se cuantificó para gotas elegidas al azar (obtenidas de un experimento de encapsulación) en cada momento. Los datos de cada punto de tiempo se presentan como un diagrama de dispersión con \({{{{{\rm{mean}}}}}\,\pm {SD}}\) barras de error.

A continuación, caracterizamos el rendimiento, la eficiencia de detección, la reproducibilidad y la tasa de falsos positivos de nuestra plataforma de descubrimiento de BsAb unicelular utilizando una biblioteca enriquecida preparada con Blinatumomab que expresa HEK293_LPCD19/Blin. Brevemente, se añadió HEK293_LPCD19/Blin a un conjunto de células HEK293_LPCD19 parentales en diferentes proporciones que oscilaban entre 0,003 y 1 %. Cada muestra de células enriquecidas se coencapsula con las células indicadoras Jurkat-ZsG para generar gotitas de ensayo utilizando un módulo de generación de gotitas, donde (a) el número promedio de células HEK293 por gotita es aproximadamente 0,3, lo que garantiza que ≥96% de las gotitas contengan cero o una celda de la biblioteca, y (b) ~78 % de las gotitas tienen cada una al menos una celda informadora, con una tasa teóricamente máxima de gotitas positivas de aproximadamente el 31 %. Tras una incubación de seis horas, las gotas de ensayo están sujetas a detección y clasificación con el módulo central de la plataforma unicelular. Las células HEK293CD19/Blin recuperadas se verifican mediante PCR unicelular (tasa de éxito del 75 al 80 %), seguida de secuenciación de Sanger. En general, descubrimos que se pueden examinar eficazmente hasta 1,5 millones de células por experimento en un solo día. Las gotas dispensadas se pueden procesar directamente o almacenar a -80 °C para su procesamiento por lotes en un momento posterior para la biología molecular y la validación funcional posteriores.

Observamos que, con las muestras de células enriquecidas con HEK293_LPCD19/Blin, en un total de 40 ejecuciones experimentales con diferentes proporciones de enriquecimiento que van del 0,003% al 1%, nuestra plataforma puede recuperar consistentemente hasta aproximadamente el 25-30% de todas las copias de este clon dentro de cada una de las muestras individuales, dado el límite superior teórico de la tasa de recuperación (p) de aproximadamente el 31% (Fig. 4a). Con muestras enriquecidas de abundancia variable de HEK293_LPCD19/Blin (tan baja como 0,003%), recuperamos consistentemente ≥1 copias del clon de cada ejecución. Mediante modelamiento de regresión múltiple (lineal y logístico de 4 o 5 parámetros), se seleccionó un modelo lineal, que tiene un R2 significativo (0,34) con un valor p de 0,0002 y cumple con los supuestos estadísticos (p. ej., varianza residual estable; independencia y normalidad de los residuales). Se muestra el modelo de predicción con un intervalo de confianza del 90% (Fig. 4b). Con este modelo de predicción, la eficiencia de detección (P), definida como la probabilidad de aislar al menos una copia de un clon positivo, viene dada por una probabilidad binomial: P = 1 − (1 − p)N (Fig. 4c), donde la probabilidad de Bernoulli “p” se refiere a la tasa de recuperación. El modelo binomial predice que nuestra plataforma es muy capaz de aislar ≥1 copia de cualquier clon funcional raro (tan solo 80 copias en un millón de células, o 0,008%) con un nivel de confianza del 95%.

un diagrama de dispersión que muestra la tasa de recuperación observada frente a la abundancia de HEK293_LPCD19/Blin añadido en células negativas en masa (un millón de HEK_LPCD19). La tasa de recuperación se define como el número de copias aisladas dividido por el número total de copias inicialmente agregadas a una muestra. Cada punto de datos ("punto") se deriva de la mezcla de \(n=3\) réplicas analíticas de muestras enriquecidas. La línea roja sólida se deriva de la regresión lineal con límites de una desviación estándar (líneas de puntos). b Tasa de recuperación prevista basada en un modelo de regresión lineal y su intervalo de confianza del 90 % (R2 = 0,34; valor de p = 0,0002; los supuestos estadísticos se cumplieron en gran medida, por ejemplo, varianza residual estable). c Predicción de la eficiencia del cribado (“P”), definida como la probabilidad de descubrir ≥1 copia de un clon positivo de un conjunto de células. Este modelo se basa en una probabilidad binomial, donde la probabilidad de Bernoulli “p” se refiere a la tasa de recuperación prevista en el modelo de regresión anterior, correspondiente a un límite inferior de confianza seleccionado (90 % de línea roja continua o 95 % de línea azul continua). .

Un factor clave adicional en la detección eficiente de alto rendimiento es controlar la tasa de falsos positivos (FPR), lo que afectará la carga de trabajo posterior, así como el costo operativo. Las células informadoras suelen exhibir un cierto nivel basal de activación inherente falsamente positiva. La principal fuente de activación falsa positiva parece ser la señalización tónica o no específica, que puede, en parte, atribuirse a la fuga del promotor. Para nuestra selección, normalmente establecemos un umbral de clasificación que tolera entre 0,1% y 1% de falsos positivos (Figura complementaria 5a). Para reducir la FPR, hemos empleado una química de ensayo ortogonal en la que tanto Jurkat-ZsG como Jurkat-E2C están coencapsulados con HEK293_LPCD19/BiTE, y donde solo se clasifican las gotas con activación de indicador dual (tanto ZsGreen como E2-Crimson positivo). . Se ha descubierto que estas lecturas de ensayos ortogonales son muy útiles para reducir drásticamente la tasa de falsos positivos a <0,01% (Figura complementaria 5b).

A continuación, evaluamos el rendimiento de nuestra plataforma de descubrimiento de BsAb unicelular para la detección de BiTE funcional a partir de una biblioteca compleja (HEK293_LPCD19/BiTE). Como referencia interna, nuestras células HEK293_LPCD19/Blin de control positivo se agregaron a células de la biblioteca HEK293_LPCD19/BiTE con una abundancia del 0,1%. Todas las células que expresan BiTE se tiñeron con tinte de seguimiento celular (CellTraceTM Violet) (CTV). Como se describió anteriormente, las células que expresan BiTE se coencapsulan en gotitas con células indicadoras Jurkat de modo que el número promedio de células HEK que expresan BiTE fue de 0,3 por gotita. Para este experimento, empleamos una mezcla 1:1 de Jurkat-ZsG y Jurkat-E2C para reducir los falsos positivos. El número promedio de células informadoras por gota fue de aproximadamente tres. Cada una de las gotitas "positivas" contiene una celda de biblioteca (CTV+, pico azul) y señales indicadoras dobles (Jurkat-ZsG y Jurkat-E2C, picos verde y rojo) después de incubar las gotitas durante aproximadamente 6 horas (Fig. 5a, b). . La capacidad de interrogar múltiples señales diferentes de forma múltiple nos permite reducir la tasa de falsos positivos (resultantes de la señalización tónica y la activación no específica de células informadoras mediante, por ejemplo, BiTE agregados) para obtener clones raros de calidad óptima. Cada gota individual se escaneó inicialmente en el primer punto de detección (Fig. 1). Cuando se detectó una gotita que contenía señales de indicador doble (Jurkat-ZsG y Jurkat-E2C) y una señal celular de biblioteca (CTV) HEK293_LPCD19/BiTE (Fig. 5b), la gotita se introdujo en el canal de clasificación. Después de eso, la gota clasificada se movió corriente abajo hacia el segundo punto de detección para una mayor confirmación de las señales fluorescentes. El segundo punto de detección puede emplear una PMT o imágenes de gotas en serie usando una cámara para proporcionar resolución espacial (Fig. 5b). Cuando la gota clasificada superó los umbrales en el segundo punto de detección, se activó un módulo dispensador para dispensar la única gota clasificada en un tubo de PCR. Las señales de cada gota positiva del primer punto y del segundo punto de detección se pueden hacer coincidir con el número de tubo de PCR para que las señales se puedan analizar más a fondo después de la clasificación para determinar si las gotas clasificadas son falsas positivas. Los múltiples puntos de detección y métodos de indexación pueden reducir aún más la tasa de falsos positivos, reduciendo así el costo general del análisis posterior.

a Gráficos de dispersión representativos de dos series de detección independientes que muestran señales de gotitas detectadas después de 6 h de incubación. Las células informadoras Jurkat-ZsG y Jurakt-E2C se coencapsularon sin las células de la biblioteca BiTE (i) o con las células de la biblioteca BiTE (ii). HEK293_LPCD19/BiTE se marcó previamente con tinte violeta CellTraceTM. También se muestran las zonas de acceso y las tasas de activación. b Perfiles e imágenes representativos de la señal de gotas (PMT) correspondientes a una celda positiva (i) y una celda negativa (ii): celda HEK293_LPCD19/BiTE (CellTraceTM Violet, azul), una celda Jurkat-ZsG activada (ZsGreen, verde) y una Célula Jurkat-E2C activada (E2-Crimson, roja). c Imagen representativa de gel de agarosa de ADN que muestra productos de PCR unicelulares de un panel de clones BiTE CD19xCD3 aislados. d Gráficos representativos de citometría de flujo para la validación funcional masiva de siete clones BiTE recuperados (obtenidos de dos ejecuciones de detección). Las células informadoras Jurkat-ZsG se cultivaron conjuntamente con CD19+ Raji en presencia de un medio de condición del día 3 recolectado de la expresión a escala de 1 ml de células Expi293FTM transfectadas con el gen BiTE que alberga plásmidos de expresión. Después de 24 h de incubación, se perfilaron las células indicadoras Jurkat-ZsG mediante citometría de flujo para medir la tasa de activación. Blinatumomab-BiTE también se transfectó y expresó en paralelo como control positivo. Se probó la funcionalidad de un total de 265 clones BiTE utilizando el ensayo de activación del indicador Jurkat-ZsG (aquí solo se representan siete clones). e Abundancia estimada de BiTE recuperados seleccionados con secuencia verificada. Tenga en cuenta que los clones 4 y 5 son extremadamente raros (abundancia de ~0,001%). La estimación de la abundancia se basa en los recuentos respectivos de los clones individuales en las secuencias de NGS, suponiendo que estos clones se amplifican proporcionalmente durante la preparación de la biblioteca de NGS.

Examinamos un total de 1,5 millones de células de la biblioteca que expresan BiTE en dos ejecuciones independientes y dispensamos gotas positivas clasificadas cada una en tubos de PCR individuales. Es de destacar que la plataforma unicelular recuperó consistentemente HEK293_LPCD19/Blin (control positivo) en cada ejecución, donde agregamos las células en diferentes proporciones entre las células HEK293_LPCD19. La figura 5a muestra un experimento de detección representativo en el que se detecta un 0,26 % de resultados positivos con un FPR bajo del 0,008 %. La Figura 5b muestra perfiles e imágenes de PMT representativos correspondientes a una gota positiva y negativa, respectivamente, utilizando nuestro ensayo tricolor (CellTraceTM Violet+ ZsG+ E2C+). Luego realizamos una caracterización funcional posterior de los candidatos clasificados. Para esto, primero subclonamos fragmentos del gen BiTE obtenidos mediante PCR específica de gen del ADNc sintetizado a partir de cada pocillo clasificado en plásmidos de expresión (ver Métodos, Figura complementaria 6). La figura 5c muestra una imagen representativa en gel de agarosa del producto amplificado por PCR a partir de ADNc de gotitas clasificadas representativas. Luego expresamos clones BiTE en un cultivo Expi293F a escala de 1 ml en un formato de placa de 96 pocillos. Luego se validaron funcionalmente doscientos sesenta y cinco clones recuperados con éxito después de la expresión y la PCR unicelular utilizando nuestro ensayo de células informadoras en un formato masivo convencional en presencia de células Jurkat-ZsG y células Raji (un subconjunto representativo de datos se muestra en Figura 5d). Usando este ensayo, confirmamos que entre los 265 clones analizados, 213 clones fueron verdaderos positivos (correspondientes a tasas de verdaderos y falsos positivos de aproximadamente el 80% y el 20%, respectivamente), que luego fueron sujetos a secuenciación y caracterización funcional adicional, incluida la T primaria. Activación celular y destrucción de células tumorales. Además del aislamiento exitoso del análogo de blinatumomab BiTE (un control positivo interno) de las muestras complejas de la biblioteca, se descubrieron 98 secuencias únicas de CD19xCD3 BiTE. Por ejemplo, dos clones (clones 4 y 5) son muy raros (cada uno con una abundancia de ~0,001%) (Fig. 5e). Es de destacar que múltiples clones, incluidos los clones representativos 1, 2 y 6, contienen un conector rígido (AEAAAKA o AEAAAKEAAAKA). Esto es una gran sorpresa, dada la opinión generalizada de que generalmente se prefiere un enlazador flexible en la interfaz entre dominios scFv62. Dos clones representativos, 4G7VL-VH-GGGGS-hu38E4.v1VH-VL (Clon 5) y 4G7VL-VH-AEAAAKA-L2KVH-VL (Clon 6) con un conector corto, flexible y rígido, respectivamente, se caracterizaron adicionalmente utilizando un primario. Ensayo de cocultivo de células T y Raji (Fig.6a-d) y validado funcionalmente para la destrucción de tumores con una eficiencia comparable a la del Blinatumomab recombinante (Fig. 6e). El clon 6 potencia una activación y un perfil citotóxico similares de las células T primarias al de Blinatumomab. Nuevamente, el Clon 6 posee un conector corto y rígido (AEAAAKA) que hasta la fecha no se ha informado en secuencias BiTE funcionales (aunque se han informado enlaces rígidos en diseños DARPin multiespecíficos63). Estos datos demuestran que el alto rendimiento y la naturaleza agnóstica de nuestra plataforma de descubrimiento unicelular permiten el aislamiento eficiente de clones funcionales raros de BsAb con propiedades únicas, que de otro modo serían imposibles utilizando métodos convencionales de prueba y error de bajo rendimiento.

a Perfil de activación de células T CD4+ (evaluado por el porcentaje de población CD69+ CD25+ doblemente positiva) en presencia de células Raji y clones BiTE purificados en concentraciones variables. b Porcentaje de células T CD4+ que expresan PD-1 en presencia de células Raji y clones BiTE purificados en concentraciones variables. c Perfil de activación de células T CD8+ (evaluado por el porcentaje de población CD69+ CD25+ doblemente positiva) en presencia de células Raji y clones BiTE purificados en concentraciones variables. d Porcentaje de PD-1 que expresa células T CD8+ en presencia de células Raji y clones BiTE purificados en concentraciones variables. e Apoptosis de células Raji en presencia de células pan T (E:T = 10:1), aisladas de PBMC de donantes y clones BiTE purificados en diferentes concentraciones evaluadas mediante tinción con anexina V/7AAD de células Raji. Los datos se presentan como gráficos XY y cada punto de datos se obtiene como una media de \(n=3\) réplicas (en el caso del clon 5 y el clon 6) para células pan T aisladas de \(n=1\) donante. PBMC. \({{{{{\rm{Media}}}}}\pm {SD}}\) se trazan barras de error para cada punto de datos. En el caso de Blinatumomab, los datos se obtienen de \(n=2\) réplicas y no se muestran barras de error.

Para dilucidar la distribución de las variables de diseño (que estaban bien distribuidas en la biblioteca inicial, Fig. 2c) en los clones ordenados que permitieron la funcionalidad de las variantes de BiTE, secuenciamos clones de BiTE funcionales basados ​​en el ensayo informador en masa utilizando secuenciación directa de colonias bacterianas con BiTE. cebadores específicos de genes y descubrió 98 secuencias únicas (más el clon de Blinatumomab enriquecido). Curiosamente, sólo dos orientaciones relativas de los scFv CD19 y CD3:

(CD19VL – VH – CD3VH – VL y CD19VH – VL – CD3VH – VL) estuvieron representados en los candidatos funcionales ordenados, lo que indica una preferencia orientativa específica por la actividad (Fig. 7a). Es de destacar que el blinatumomab clínicamente aprobado emplea la orientación (CD19VL–VH–CD3VH–VL). Es posible que otras orientaciones relativas VH-VL, incluidas CD19VL-VH-CD3VL-VH y CD19VH-VL-CD3VL-VH sean estructuralmente desfavorables para la unión y/o expresión64,65. Además, también notamos la representación insuficiente (6–8%) de h38E4.v1 CD3 scFv y FMC63 CD19 scFv en la biblioteca funcional ordenada (Fig. 7a) a pesar de su representación significativa en la biblioteca original. En particular, no vemos ningún BiTE funcional que comprenda un scFv h38E4.v1 CD3 y un scFv FMC63 CD19 en nuestra biblioteca funcional ordenada, independientemente de la orientación o el tipo de conector (Tabla complementaria 5). La subrepresentación de FMC63 CD19 scFv es particularmente sorprendente ya que es la base para las terapias CAR-T aprobadas47,60,61, lo que implica que BiTE y CAR-T emplean diferentes MOA incluso con el mismo scFv potencialmente debido a diferencias en la expresión o plegamiento entre La proteína soluble se forma en BiTE y la proteína de la superficie celular en CAR. Además, queda por determinar la asociación de la representación insuficiente de FMC63 CD19 con el epítopo de unión o la afinidad, ya que 4G7 CD19 scFv, que comparte un epítopo de unión en CD19 similar al de FMC63 y posee una afinidad casi 10 veces menor que FMC6346,47, está representado en un nivel del 36% en la biblioteca ordenada funcionalmente. Esta representación diferencial observada podría deberse potencialmente a la eficiencia de la expresión de proteínas de diferentes formatos moleculares de las células huésped (HEK293) en el ensayo de gotitas, que se examinará en trabajos futuros. De ser cierto, nuestra plataforma de descubrimiento de células individuales podría no solo detectar la funcionalidad sino también la "capacidad de desarrollo" (p. ej., expresión eficiente) de moléculas candidatas en el mismo ensayo, acelerando así aún más el desarrollo de fármacos. Estaremos particularmente interesados ​​en evaluar si dicha evaluación de la "capacidad de desarrollo" se puede aplicar a otros formatos de BsAb de cadena múltiple de longitud completa (p. ej., formato IgG) que pueden producir moléculas desapareadas. Además, los cuatro tipos de enlazadores utilizados en la biblioteca están bien distribuidos en los clones ordenados. Una vez más, los enlazadores rígidos son igualmente funcionales, contrariamente a lo que se pensaba anteriormente. También observamos que el cribado funcional utilizando la plataforma de descubrimiento de células individuales puede identificar residuos conservados clave en el dominio CDRH3 necesarios para mantener las funciones de BsAb (Fig. 7b). Por ejemplo, identificamos residuos como Y10 e Y11 en B43 CDRH3 que no son permisivos para las mutaciones y son críticos para la funcionalidad de BiTE (Fig. 7b). En conjunto, estos datos sugieren que nuestro proceso de descubrimiento de células individuales que interroga múltiples variables de manera combinatoria y de alto rendimiento puede, por primera vez, informar los principios de diseño de BsAb y revelar la relación entre las secuencias de BsAb con resolución de residuo único y la función resultante. .

a Distribución de la orientación relativa de los scFv CD19 y CD3 (i), Distribución de los scFv CD3 (ii), Distribución de los scFv CD19 (iii) y enlazadores (iv) en la biblioteca ordenada funcionalmente activa. La secuencia de 99 clones funcionales de BiTE (98 clones únicos + 1 secuencia de Blinatumomab) dilucidada mediante secuenciación de Sanger se utilizó para analizar la distribución de los parámetros de diseño. b Composición de CDRH3 de BiTE clasificados que tienen un scFv aCD19 4G7 (i), B43 (ii), JUNO241 (iii) o FMC63 (iv). Las composiciones de CDRH3 para cada tipo de scFv CD19 se analizaron a partir de n = 34 4G7 que contenían BiTE, n = 25 B43 que contenían BiTE, n = 29 JUNO241 que contenían BiTE y n = 8 FMC63 que contenían BiTE. Se excluyeron tres clones del análisis de CDRH3 debido a ambigüedad de secuencia en la región CDRH3.

Actualmente, la inmunoterapia está revolucionando los tratamientos de muchos trastornos, incluido el cáncer. Los BsAb representan uno de los subsectores de más rápido crecimiento en inmunoterapia debido a sus novedosos modos de acción. Sin embargo, la ineficiencia del actual paradigma de descubrimiento inmunoterapéutico ha limitado la disponibilidad clínica de los BsAb para una amplia gama de enfermedades. El enfoque convencional de prueba y error, en el que los BsAb se diseñan empíricamente y luego deben evaluarse individualmente para determinar su funcionalidad, generalmente es sesgado, tedioso, lento y costoso. El proceso de descubrimiento de BsAb unicelular presentado aquí difiere de los métodos convencionales basados ​​en placas de microtitulación en sus principios de funcionamiento al emplear un cribado altamente paralelo, de alto rendimiento, imparcial y basado en una sola célula, que interroga directamente las funcionalidades terapéuticamente relevantes de las moléculas candidatas. . Nuestra plataforma puede acelerar el desarrollo de productos inmunoterapéuticos para hacer potencialmente más y mejores BsAb rápidamente disponibles y asequibles para los pacientes, gracias a las siguientes características superiores en comparación con los métodos convencionales: (a) Adaptabilidad y escalabilidad: nuestra plataforma es agnóstica, lo que significa que se pueden usar formatos de BsAb independientes. examinado directamente para determinar su funcionalidad sin necesidad de conocimiento previo de las características de unión de BsAb/antígeno; (b) Rendimiento y eficiencia de detección: nuestra plataforma puede acomodar millones de clones de BsAb individuales por ejecución, en comparación con entre decenas y cientos de clones (métodos de manipulación manual de placas de microtitulación) o entre miles y decenas de miles de clones (sistemas robóticos de manipulación de líquidos) en métodos convencionales (es decir, aumento de 100 a 1000 veces el rendimiento); Un mayor rendimiento significa que se puede comenzar con una biblioteca mucho más grande con mayor diversidad de variantes, lo que por lo tanto aumenta la tasa de éxito en la obtención de clones deseados, incluidos clones de alta calidad y poca abundancia de un gran grupo heterogéneo; (c) Respuesta rápida: Excluyendo las transiciones (por ejemplo, servicios NGS subcontratados), la respuesta estimada para los procesos principales en una campaña de descubrimiento de BsAb comprenderá: (i) preparación de la biblioteca: 5 a 6 semanas (semanas); y en paralelo, preparación/validación de células informadoras: 3 a 5 semanas; (ii) 1 a 2 veces pruebas de detección: 1 a 2 días; (iii) validación posterior para ≤96 visitas: 3 a 4 semanas. El proceso general suele tardar de 8 a 10 semanas para interrogar entre 10.000 y 100.000 variantes de BsAb, en comparación con ≥10 a 12 semanas necesarias para entre 100 y 1.000 BsAb utilizando un sofisticado sistema de manipulación de líquidos. (d) Costo reducido: nuestro ensayo unicelular se realiza en gotitas de menos de nanolitros y solo requiere un pequeño volumen de muestra con un costo significativamente menor de reactivos y muestras biológicas.

Otros sistemas de microfluidos de gotas66,67,68,69,70, ensayos de micropocillos71, optofluidos72 y matrices de microcapilares73 se han aplicado anteriormente para el descubrimiento de anticuerpos, pero operan con ensayos basados ​​en unión con un rendimiento moderado o se centran de otro modo en otras áreas de descubrimiento. no aplicable directamente al BsAb. Un estudio reciente empleó un cribado funcional basado en una sola célula, pero requirió múltiples rondas de enriquecimiento74, mientras que las innovaciones en la plataforma de descubrimiento de BsAb unicelular que se informan aquí, incluida la construcción de una biblioteca de variante única a través de un sistema de plataforma de aterrizaje modular dirigido al sitio, ortogonal multiplexada. la química del ensayo y la detección multipunto y la estrategia de indexación de gotas nos permiten minimizar los falsos positivos e interrogar bibliotecas grandes a una profundidad mucho mayor y menor abundancia (0,001%). Hemos demostrado que nuestra plataforma puede descubrir clones extremadamente raros con propiedades únicas que de otro modo serían intratables utilizando métodos convencionales de prueba y error, sesgados y de bajo rendimiento. Nuestro ensayo informador se utiliza como un ensayo de "sí o no" para enriquecer clones funcionales para una mayor caracterización posterior. El trabajo futuro determinará la correlación entre la intensidad de la señal del informador y la potencia de las moléculas impactadas; Si el ensayo del reportero puede "clasificar" cuantitativamente a los candidatos según su potencia, esta tecnología mejorará aún más la eficiencia del descubrimiento.

Los parámetros estructurales y compositivos en el diseño de BsAb pueden afectar la función de BsAb de una manera delicada pero integral. Nuestra indexación de gotas podría vincular lecturas funcionales y fenotípicas de aciertos individuales con la genética unicelular posterior (p. ej., secuencias de BsAb). Además, dado que nuestra plataforma de descubrimiento de una sola celda puede interrogar simultáneamente múltiples variables de diseño de una manera combinatoria y de alto rendimiento, podemos, por primera vez, comenzar a descifrar los principios de diseño de BsAbs y obtener una comprensión profunda de la interacción. Relaciones entre la estructura y función de la secuencia de BsAb. Reconocemos que el análisis de 98 clones clasificados en el estudio de prueba de concepto actual es insuficiente, pero la relación entre secuencia y función puede revelarse con experimentos adicionales y un gran conjunto de datos que se generará en el futuro. Obtener información relevante sobre estas interrelaciones nos permitiría transformar el desarrollo de BsAb y potencialmente otras inmunoterapias de un proceso de prueba y error a una práctica de ingeniería racional. Si bien este estudio piloto solo pudo caracterizar dos moléculas de los resultados positivos por sus efectos sobre la activación de las células T y la destrucción de tumores, planeamos investigar más clones de los BiTE CD19xCD3 descubiertos en nuestra compleja selección de bibliotecas, lo que potencialmente puede conducir a más candidatos terapéuticos óptimos que el parámetro de referencia Blinatumomab. Además, interrogaremos el papel y el mecanismo de los conectores rígidos, las orientaciones VL/VH preferidas, la afinidad de unión y el epítopo de scFv, los residuos conservados y la eficiencia de la expresión en la funcionalidad BiTE. Los ensayos funcionales adicionales basados ​​en células individuales pueden mejorar aún más la utilidad de nuestra tecnología de plataforma, que incluye ensayos de función efectora de células inmunitarias relevantes para la secreción de citoquinas, el metabolismo y/o la destrucción de tumores. Esta evaluación multifacética puede facilitar el desarrollo de BsAb que exhiban funciones terapéuticas óptimas para la traducción clínica. Nuestro enfoque BsAb basado en una plataforma unicelular representa un enfoque único para apuntar ampliamente a objetivos muy buscados pero complejos y desafiantes, como los receptores de superficie celular de múltiples subunidades.

Para generar un conjunto de bibliotecas de ADN de variantes de BiTE en un plásmido donante que contiene "attB", primero preparamos una subbiblioteca de ADN plasmídico de scFv CD19 y CD3 conmutados de orientación (Tabla complementaria 1, Tabla complementaria 6). Cada candidato a subbiblioteca se normalizó en los seis residuos terminales de las porciones N-terminal y C-terminal de los dominios VH y VL (Tabla complementaria 6). A continuación, utilizando grupos de cebadores definidos diseñados con mutaciones "NNW" en cada posición CDRH3 de los scFv CD19, preparamos variantes de CDRH3 de cada subbiblioteca candidata en el grupo de subbiblioteca CD19 scFv (subbiblioteca CD19-NNW). Las secuencias de cebador que codifican las mutaciones NNW en cada residuo de CDRH3 de los scFv CD19 se muestran en la Tabla complementaria 7. A continuación, preparamos un vector plasmídico base que tenía un sitio de clonación múltiple (MCS) que constaba de sitios de restricción EcoR1 y Kpn1 intercalados entre una secuencia señal ( 5'-ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCAGCCACAGGCGCCTATGCT-3') y secuencia histag-2A (5'-CACCACCACCATCACCATGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCT-3'). El vector plasmídico base tenía además un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción HindIII aguas arriba de la secuencia señal y un sitio de reconocimiento BamH1 aguas abajo de la secuencia histag-2A, para permitir la extracción del casete de expresión BiTE completo (secuencia señal-gen BiTE-histag-2A). Uso de un panel de 16 ssOligos (oligos enlazadores) para codificar la biblioteca de enlazadores de cuatro miembros (Tabla complementaria 3, Tabla complementaria 8) con extremos de recocido apropiados para acomodar las cuatro orientaciones relativas posibles de los scFv CD19 y CD3 y cuatro recocidos de oligos adicionales A los residuos N-terminal y C-terminal normalizados de los dominios VH o VL, amplificamos por PCR las variantes CD3 de la subbiblioteca CD3-scFv, así como las variantes CD19 de la subbiblioteca CD19-NNW-scFv. Los cebadores utilizados para la PCR de variantes de CD19 de la subbiblioteca CD19-NNW-scFv y la PCR de variantes de CD3 de la subbiblioteca CD3-scFv se muestran en la Tabla complementaria 8. Después de la purificación y cuantificación en gel, los productos de la PCR se mezclaron en proporciones equimolares y se ensamblaron en el vector plasmídico base linealizado descrito anteriormente utilizando una mezcla maestra interna de Gibson. Específicamente, se ensamblaron 100 ng de fragmentos de PCR con 250 ng de vector plasmídico linealizado (vector plasmídico base digerido EcoR1/Kpn1) en 200 µl de reacción de Gibson, se transformaron en 220 µl de células competentes DH5\(\alpha\) y se recuperaron en 1 mL de medio SOC durante 1 hora sin selección. Los cultivos recuperados de 1 ml se ampliaron a 30 ml de medio TB con 100 µg/ml de ampicilina. El ADN extraído del cultivo de 30 ml se digirió con HindIII-HF (#R3104S, New England Biolabs) y BamH1-HF (#R3136S, New England Biolabs), y se extrajeron fragmentos BiTE de longitud completa (~1,6 kb) usando gel de agarosa. extracción. Los fragmentos BiTE de longitud completa purificados en gel se ensamblaron luego en un plásmido donante "attB" sin promotor. El plásmido donante "attB" sin promotor contenía el casete de señal Secuencia-(EcoR1/Kpn1) MCS-histag-2A-Puromicina aguas abajo del sitio de unión "attB". La linealización del plásmido donante sin promotor con enzimas de restricción EcoR1/Kpn1 permitió el ensamblaje de Gibson de fragmentos BiTE purificados en gel en marco con una secuencia señal y una secuencia de Puromicina aguas abajo. Además, también preparamos un vector de plásmido donante "attB" que codifica Blinatumomab BiTE utilizando el plásmido de subbiblioteca CD19 que codifica B43, la secuencia L2K que codifica el plásmido CD3 y un ssOligo que codifica un conector corto "GGGGS" y extremos de hibridación con VH-Cterm y VL-Nterm. La secuencia de Blinatumomab utilizada se muestra en la Tabla complementaria 6.

Obtuvimos líneas celulares HEK293 integradas con una única copia del sitio de unión "attP" específico de la recombinasa BxB1 (HEK_LP) de Applied Stem Cell (# AST-1305, Applied Stem Cell). Cotransfectamos nuestro plásmido de expresión Cas9 (pCas9) generado internamente y el plásmido de ARNg (pGRNA) (específico para la integración en el locus Chr 1) con el plásmido de expresión CD19 que contiene un promotor CAG (pCD19) en las líneas celulares HEK293_LP. La relación de masa de los plásmidos se mantuvo en 0,33:0,66:1 (pCas9:pGRNA:pCD19). Las transfecciones se realizaron utilizando el reactivo de transfección Fugene® HD utilizando el protocolo estándar de los fabricantes. Específicamente, se transfectaron 2 µg de ADN total en 1 × 106 millones de células HEK293_LP. Las células se seleccionaron usando higromicina y la población estable se clasificó en nuestra plataforma unicelular para los niveles de expresión de CD19 tiñendo las células transfectadas con el anticuerpo anti-CD19 AlexaFluor® 647 (n.° 302222, Biolegend). Las células se clasificaron según diferentes niveles de expresión de CD19, y se eligieron líneas celulares clonales con niveles de expresión comparables a las de líneas celulares positivas para CD19 estándar, como Raji, NALM-6 y SUDH, para experimentos posteriores. Estas células se denominan HEK293_LPCD19.

En total, se transfectaron 3 x 106 células HEK293_LPCD19 con 60 µg de plásmido de expresión de recombinasa BxB1 (n.° AST 3201, células madre aplicadas) y la biblioteca de plásmido donante “attB” integrada en el gen BiTE descrita anteriormente, en una proporción de 1:3. La transfección se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección Xfect (n.° 631318, Takara Bio) según el protocolo del fabricante. Después de la transfección, las células integradas BiTE se enriquecieron con selección con 1 µg/ml de puromicina durante 48 h y se usaron para la clasificación y detección de gotitas posteriores o para el ensayo en masa.

En total, se transfectaron 3 x 105 células HEK293_LPCD19 con 2,5 µg de plásmido de expresión de recombinasa BxB1 (# AST 3201, células madre aplicadas) y plásmido donante “attB” integrado en el gen blinatumomab en una proporción de 1:3. La transfección se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección Xfect (n.° 631318, Takara Bio) según el protocolo del fabricante. Después de la transfección, las células integradas con blinatumomab se enriquecieron con selección con 1 µg/ml de puromicina durante 48 h y se usaron para la clasificación y detección de gotitas posteriores o para el ensayo en masa.

El ADN genómico se extrajo de 3 × 106 células HEK293_LPCD19/BiTE utilizando el kit Quick-DNA midiprep (n.º D4075, Zymo Research). Se utilizaron cebadores específicos de genes que se unen a la secuencia señal (5'-CTGGTCCTGCATCATCCTCGTTTC-3') y la secuencia P2A (5'-GTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGG-3') para amplificar variantes BiTE del ADN genómico. La amplificación se llevó a cabo con 500 ng de ADN genómico molde (correspondiente a un número de copias del gen de 145.000) con una temperatura de hibridación de 69 °C y un tiempo de extensión de 1 min 30 s, utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad NEB Q5 (#MO491 , Nueva Inglaterra Biolabs Inc.). La región genómica que contiene secuencias BiTE integradas amplificadas por PCR se purificó en gel y se analizó mediante secuenciación de amplicones de lectura larga (PacBio, SMRT). Las lecturas circulares de consenso (~3 millones de lecturas CCS) de la secuenciación de amplicones de lectura larga se analizaron en busca de secuencias genéticas que contenían tanto la secuencia señal N-terminal como la etiqueta his C-terminal intercalando la región BiTE utilizando servicios bioinformáticos proporcionados por el proveedor FornaxBio (Worcester, MAMÁ). Estas secuencias de genes se tradujeron y analizaron en busca de secuencias únicas y duplicadas. Las secuencias BiTE únicas se ordenaron además por tipo de conector, orientación VH-VL de los scFv CD19 y CD3 y representación de los scFv candidatos. El análisis de secuencia se llevó a cabo utilizando scripts generados en R utilizando paquetes de biblioteca estándar (stringr, Biostrings).

Para la encapsulación de gotas, utilizamos una distribución de Poisson estándar (\({P}_{\lambda ,\,k}=\frac{{{e}^{-\lambda }\lambda }^{k}}{k! }\)) donde \(\lambda\) es el número medio de células en una gota, k es el número de células en las gotas y \({P}_{\lambda ,k}\) es la probabilidad de que una la gota contiene k células, para modelar la distribución de células en las gotas. La concentración de células se calcula en función del \(\lambda\) necesario y del tamaño medio de las gotas (77 µm). Realizamos dos pruebas de detección en nuestra plataforma. Una muestra que contenía células indicadoras Jurkat-ZsG y Jurkat-E2C se mezcló en una proporción de 1:1 \((\lambda =3)\) con la otra muestra que contenía células de la biblioteca HEK293_LPCD19/BiTE \((\lambda =0.3)\) se dispersaron en gotas mediante un aceite portador inmiscible utilizando un generador de gotas de enfoque de flujo (fabricado en una instalación de sala limpia en UC Irvine). El aceite portador era aceite fluorado Novec HFE7500 (3 M) que contenía 2 % (peso/peso) de 008-FluoroSurfactant (Ran Biotechnologies). Las células HEK_LPCD19/BiTE se tiñeron previamente con CellTraceTM Violet (#C34571, ThermoFisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Los caudales se ajustaron para generar gotas con un diámetro de aproximadamente 77 µm. Las gotas se recogieron en una jeringa con tapa y se incubaron a 37 °C durante 6 h. Después de la incubación, las gotas se reinyectaron en otro chip de microfluidos para detectarlas y clasificarlas en la plataforma unicelular. La plataforma unicelular incluye cuatro láseres de longitud de onda de 405, 488, 561 y 638 nm en el primer punto de detección y dos láseres de longitud de onda de 488 y 638 nm en el segundo punto de detección. Las señales fluorescentes de las gotas se detectaron utilizando tubos fotomultiplicadores. El algoritmo de clasificación fue programado por LabVIEW. Cuando una gota superaba los umbrales, se activaba un alto voltaje para empujar la gota hacia el canal de clasificación. La gota clasificada se movió río abajo hacia el segundo punto de detección para una doble confirmación de las señales fluorescentes. Cuando la gota clasificada superó los umbrales en el segundo punto de detección, se activó un módulo dispensador para dispensar la única gota clasificada en un tubo de PCR. Los perfiles de pico de cada gota objetivo detectada en los PMT se comparan con el número de tubo de PCR que contiene la gota objetivo, de modo que los perfiles de pico se puedan revisar manualmente para decidir si se realiza un análisis posterior, es decir, PCR unicelular o no. Este método de indexación de gotas reduce aún más la tasa de falsos positivos y reduce el costo general del análisis posterior. Todas las gotas que no superaron los umbrales se eliminaron del canal de residuos.

El dispensador de gotas comprende una etapa motorizada tridimensional hecha a medida que mueve una boquilla de un tubo de PCR a otro tubo de PCR según un disparador del sistema de detección. Cuando el sistema de detección detecta y clasifica una gota positiva, se inicia un temporizador interno. Cuando la gota clasificada pasa por el segundo punto de detección en el canal de recolección, se cruza el tiempo y, si la gota llega dentro de un período de tiempo designado, el sistema de detección enviará un disparador digital simple al sistema dispensador. Al recibir la señal, el dispensador moverá la boquilla de un tubo de PCR de desecho a un tubo de PCR de recolección que contiene una solución hipotónica de RNAsin (una enzima que elimina los inhibidores de RNAse). La emulsión de una sola gota se rompe mediante tres ciclos de congelación y descongelación, y las células contenidas sufrirán una lisis osmótica debido a la solución hipotónica y liberarán el contenido de ARN. Luego, las muestras se procesarán mediante RT-PCR y amplificación de ADNc.

El ADNc de las células de las gotitas clasificadas se sintetizó con ARN total y se extrajo utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini (n.º 74104, QIAGEN). Específicamente, reunimos cebadores hexámeros aleatorios con 10 pg de ARN total extraído de células individuales en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 1 µl de cebadores hexámeros aleatorios 50 µM, 1 µl de mezcla de DNTP y 10 pg de ARN total. La reacción de recocido se llevó a cabo a 65 °C durante 5 min. El cebador recocido y el ARN total se mezclaron con 4 µl de tampón SSIV 5X (n.º 18090050B, ThermoFisher Scientific), 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de inhibidor de ribonucleasa y 1 µl de transcriptasa inversa SuperScriptTM IV (n.º 18090200, ThermoFisher Scientific) y Se incubaron a 23 °C durante 10 min y luego a 55 °C durante 10 min. Después de esto, la reacción se inactivó a 80 °C durante 10 min. Amplificación del gen BiTE a partir del ADNc utilizando un cebador de PCR directo específico del gen BiTE que se hibrida con la secuencia señal (5'-GCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTG-3') que se hibrida con la secuencia señal y un cebador de PCR inverso que se hibrida con la secuencia 2A (5'-CCGGGGTTTTCTTCCACGTCTCC-3' ). Se realizó una segunda PCR anidada con una plantilla de la primera PCR para mejorar la especificidad de amplificación del producto. Para esto, se utiliza un cebador directo que se hibrida con la secuencia señal (5'-CTCGGTTCTATCGATTGAATTCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATC-3') y un cebador inverso que se hibrida con la región histag (5'-TTGGGGCCATGGCGGCCTTAATGGTGATGGTGGTGGTGCTTGATTTC-3'). Los cebadores también agregaron sitios de restricción terminales (EcoR1 y HindIII) al producto de la PCR para hacerlo susceptible de inserción en plásmidos de expresión. Se ensambló 1 µl de plásmido de expresión linealizado con 3 µl de cada producto amplificado por PCR utilizando 4 µl de NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix (#E2621L, New England Biolabs) en un formato de placa de 96 pocillos. Los productos génicos ensamblados se transformaron directamente en 30 µl de células XL1-Blue competentes y se recuperaron durante 30 minutos en 200 µl de SOC sin selección en un formato de placa de 96 pocillos. Las células bacterianas recuperadas de cada pocillo se inocularon en 2 ml de medio TB con 100 µ\({{{\rm{g}}}/{mL}}\) de ampicilina durante 12 a 16 h a 37 °C. Después de la incubación durante la noche, se extrajo el ADN de las células bacterianas utilizando el kit de minipreparación de plásmidos ZymoPURE (#D4212, Zymo Research) utilizando el protocolo del fabricante. Se cuantificó la concentración de cada uno de los ADN extraídos.

Los candidatos BiTE clasificados ensamblados en plásmidos de expresión luego se transfectaron en células Expi293FTM de 1 ml (#A14527, ThermoFisher Scientific) usando el kit de transfección ExpifectamineTM 293 (#A14524, ThermoFisher Scientific) según el protocolo del fabricante en placas de cultivo de 2 ml de 96 pocillos. Setenta y dos horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante de BiTE y se utilizó para el ensayo de activación del indicador en masa.

Se mezcló setenta y dos horas de sobrenadante que contenía BiTE (descrito anteriormente) con 5 x 104 células Jurkat-ZsG y 5 x 104 células Raji durante 24 h en una placa de fondo en V de 96 pocillos. Luego, las células se lavaron con PBS y se analizaron para determinar la expresión de la proteína fluorescente zsGreen. La población de células Jurkat-ZsG activadas se identificó según la estrategia de activación descrita en la figura complementaria 7.

Las células Pan T se aislaron de PBMC de donantes (n.° 70025, StemCell Technologies) utilizando el kit de aislamiento de células T humanas EasySepTM (n.° 17951, StemCell Technologies). Se mezclaron 10.000 células Raji con 100.000 células T en medios que contenían diferentes concentraciones de clones BiTE purificados (clon 5 y clon 6). Después de 48 h, se recogieron la mitad de las células y se tiñeron con 7AAD (n.° 50-850-582, Fisher Scientific) y anexina V (n.° 640906, Biolegend) y anticuerpo anti-CD4 humano PE/cianina 7 (n.° 317414, Biolegend). ), anticuerpo anti-CD8 humano APC/cianina 7 (#344714, Biolegend). La población de células Raji de Anexina V+ y 7AAD+ se obtuvo seleccionando células T (CD4+/CD8+) (Figura complementaria 8). La otra mitad se tiñó con un cóctel que contenía 7AAD, anticuerpo PE-CD69 antihumano (#310906, Biolegend), anticuerpo FITC-anti-CD25 humano (#356106, Biolegend), anticuerpo APC anti-CD279 humano (#329908, Biolegend), Anticuerpo anti-CD4 humano PE/cianina 7 (n.° 317414, Biolegend), anticuerpo anti-CD8 humano APC/cianina 7 (n.° 344714, Biolegend). La apoptosis total de las células Raji se obtuvo seleccionando la población 7AAD+ y Anexina V+ después de seleccionar las células T (CD4+ CD8+). El porcentaje de células T CD4+ CD69+ CD25+, células T CD4+ PD-1+, células T CD8+ CD69+ CD25+, células T CD8+ PD-1+ se obtuvieron seleccionando una subpoblación de células T solo CD4+ y células T solo CD8+ de la vida (7AAD −) Células T (Figura complementaria 9). Todas las concentraciones de anticuerpos se utilizaron en la concentración recomendada por los proveedores.

Los plásmidos de expresión BiTE correspondientes a variantes funcionales de BiTE se retransformaron en células competentes XL1-blue y se sembraron en placas sobre LB Agar Ampicilina (100 µg/ml). Se inocularon tres colonias por candidato BiTE durante 6 h a 37 °C en 500 µl de ampicilina TB (100 µg/ml) en placas de cultivo bacteriano de 2 ml y 96 pocillos. Se pipetearon 100 µl del cultivo en una placa de PCR de 96 pocillos y se utilizaron para la generación de plantillas RCA y la secuenciación de Sanger. ELIM Biopharm (Hayward, CA) proporcionó el servicio para la generación de plantillas RCA y la secuenciación de Sanger. Para la secuenciación de Sanger, utilizamos un cebador directo (5'-AACATCCACTTTGCCTTTCTCTCC-3') que se une a la secuencia de señal y un cebador inverso (5'-GGACAAACCACAACTAGAATGCAG-3') que se une a histag.

Se expresaron dos BiTE clasificados con conectores cortos, rígidos y flexibles (4G7VL – VH-AEAAAKA-L2KVH – VL y 4G7VL – VH-GGGGS-hu38E4.v1VH – VL a partir de una escala de transfección de 30 ml. Los BiTE se purificaron a partir del medio acondicionado del día 3 usando la etiqueta C-terminal 6×His y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (Cytiva, #29051021) en el sistema FPLC ÄKTAExplorer100 (Cytiva). Después de la elución con un gradiente de imidazol, las proteínas BiTE se tamponaron, se intercambiaron con PBS y se concentraron usando Amicon Ultra. -15 tubos de corte de ultracentrifugación de 10 kDa (Millipore Sigma, #UFC901096D).

Se utilizó un tamaño de muestra comúnmente aceptado de (n=30) para cuantificar la activación del indicador en gotitas en presencia de células Raji y anticuerpo blinatumomab. Para evaluar el rendimiento de nuestra cartera, agregamos Blinatumomab que expresaba células HEK293_LPCD19 en diferentes proporciones en un conjunto de células HEK293_LPCD19 negativas para Blinatumomab. Para este experimento, se utilizaron \(n=3\) réplicas analíticas de las diferentes muestras enriquecidas. Se generaron modelos de regresión con un valor de p aceptable (p = 0,0002). La caracterización de los BiTE recién descubiertos se realizó con \(n=3\) réplicas analíticas. Los datos para evaluar la diversidad de secuencias BiTE integradas en la línea celular HEK293_LPCD19/BiTE provienen de un experimento de integración, ya que no esperamos que la eficiencia de la integración afecte la diversidad. Se realizaron dos pruebas de detección independientes utilizando sistemas de microfluidos de gotitas de alto rendimiento, y ambas pruebas arrojaron características de rendimiento similares, lo que resultó en la identificación de 98 resultados positivos de BiTE.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de respaldo están disponibles en este artículo como información complementaria. Los datos brutos utilizados para generar las cifras también se incluyen en la información de respaldo (Datos complementarios 1). Otros conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

En este estudio no se utilizó ningún software o código personalizado.

Labrijn, AF, Janmaat, ML, Reichert, JM y Parren, PWHI Anticuerpos biespecíficos: una revisión mecanicista del proceso. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 18, 585–608 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dahlén, E., Veitonmäki, N. & Norlén, P. Anticuerpos biespecíficos en inmunoterapia contra el cáncer. El r. Adv. Vacunas Inmunotras. 6, 3-17 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Q. Anticuerpos biespecíficos para enfermedades autoinmunes e inflamatorias: progreso clínico hasta la fecha. BioDrugs 34, 111-119 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Peyrin-Biroulet, L., Demarest, S. y Nirula, A. Anticuerpos biespecíficos: la próxima generación de terapias dirigidas a la enfermedad inflamatoria intestinal. Autoinmune. Rev. 18, 123–128 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Baeuerle, PA y Reinhardt, C. Anticuerpos biespecíficos que atacan a células T para la terapia del cáncer. Res. Cáncer. 69, 4941–4944 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Trabolsi, A., Arumov, A. y Schatz, JH Anticuerpos biespecíficos activadores de células T en la terapia del cáncer. J. Inmunol. 203, 585–592 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Qi, J. y col. Un anticuerpo biespecífico contra IL-1β e IL-17A es beneficioso para la artritis reumatoide experimental. En t. Inmunofarmacol. 14, 770–778 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lee, D. y col. El bloqueo simultáneo de VEGF y Dll4 por HD105, un anticuerpo biespecífico, inhibe la progresión tumoral y la angiogénesis. mAbs 8, 892–904 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaplon, H. y col. Anticuerpos a tener en cuenta en 2023. mAbs 15, e2153410 (2023).

Artículo de Google Scholar

Clynes, RA y Desjarlais, JR Citotoxicidad de células T redirigidas en la terapia del cáncer. Año. Rev. Med. 2019 70, 437–450 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Sampei, Z. y col. Identificación y optimización multidimensional de un anticuerpo IgG biespecífico asimétrico que imita la función de la actividad del cofactor del factor VIII. MÁS UNO 8, e57479 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krah, S. y col. Ingeniería de anticuerpos biespecíficos con emparejamiento de cadenas definido. N. Biotecnología. 39, 167-173 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Eigenbrot, C. & Fuh, G. Anticuerpos dos en uno con Fabs de doble acción. actual. Opinión. Química. Biol. 17, 400–405 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Segal, DM y cols. Liberación de citocinas por linfocitos de sangre periférica a los que se dirigen anticuerpos biespecíficos y su papel en el bloqueo del crecimiento tumoral. Ana. Académico de Nueva York. Ciencia. 636, 288–294 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jackman, J. y col. Desarrollo de una estrategia de dos partes para identificar un anticuerpo biespecífico humano terapéutico que inhiba la señalización del receptor de IgE. J. Biol. Química. 285, 20850–20859 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weiner, L., Alpaugh, R. y von Mehren, M. Citotoxicidad celular redirigida empleando anticuerpos biespecíficos y otras proteínas de unión multifuncionales. Inmunol contra el cáncer. Inmunotro. 45, 190-192 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Linke, R., Klein, A. y Seimetz, D. Catumaxomab: desarrollo clínico y direcciones futuras. mAbs 2, 129-136 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Klein, C. y col. Progresos para superar el problema de la asociación de cadenas en anticuerpos IgG heterodiméricos biespecíficos. mAbs 4, 653–663 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Asano, R. y col. El orden de dominio de un diacuerpo biespecífico mejora drásticamente su actividad antitumoral más allá de la conversión de formato estructural: el caso del diacuerpo hEx3. Ing. Proteínas. Des. Sel. 26, 359–367 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Núñez-Prado, N. et al. La mayoría de edad de los anticuerpos multivalentes diseñados. Descubrimiento de drogas. Hoy 20, 588–594 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Stieglmaier, J., Benjamin, J. & Nagorsen, D. Utilización de la plataforma BiTE (participante de células T biespecíficas) para la inmunoterapia del cáncer. Experto. Opinión. Biol. El r. 15, 1093–1099 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sugiyama, A. y col. Un método de rendimiento medio alto para detectar pequeños anticuerpos biespecíficos con alta citotoxicidad. Ciencia. Rep. 7, 2862 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Dengl, S. y col. Intercambio de cadena de formato (FORCE) para anticuerpos biespecíficos de generación de alto rendimiento en matrices combinatorias de formato aglutinante. Nat. Comunitario. 11, 4974 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J. y col. El epítopo proximal a la membrana facilita la formación eficiente de sinapsis de células T mediante anti-FcRH5/CD3 y es un requisito para la destrucción de células de mieloma. Célula cancerosa 31, 383–395 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

James, SE y cols. La sensibilidad al antígeno del TCR quimérico específico de CD22 está modulada por la distancia del epítopo objetivo desde la membrana celular. J. Inmun. 180, 7028–7038 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Raíz, A. et al. Desarrollo de PF-06671008, una molécula DART biespecífica anti-P-cadherina/anti-CD3 muy potente y con vida media prolongada para el tratamiento del cáncer. Anticuerpos 5, 6 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bluemel, C. y col. La distancia del epítopo a la membrana celular diana y el tamaño del antígeno determinan la potencia de la lisis mediada por células T mediante anticuerpos BiTE específicos para un antígeno de superficie de melanoma grande. Inmunol contra el cáncer. Inmunotro. 59, 1197-1209 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Qi, J. y col. Actividad antitumoral potente y selectiva de un anticuerpo biespecífico que ataca a las células T y que se dirige a un epítopo de ROR1 proximal a la membrana. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 115, E5467–E5476 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, JS y cols. Estrategia versátil para controlar la especificidad y actividad de las células T diseñadas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 113, E450-E458 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goebeler, ME y cols. Construcción de anticuerpo biespecífico contra células T (BiTE), Blinatumomab para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin en recaída/refractario: resultados finales de un estudio de fase I. J.Clin. Oncol. 34, 1104-1111 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Moore, GL y cols. Un nuevo formato de anticuerpo biespecífico permite la participación simultánea bivalente y monovalente de distintos antígenos diana. mAb. 3, 546–57 (2011).

Moore, GL y cols. El ajuste de la afinidad de las células T mejora la eficacia y la seguridad de los anticuerpos biespecíficos Anti-CD38 × Anti-CD3 en monos, una terapia potencial para el mieloma múltiple. Sangre 126, 1798–1798 (2015).

Artículo de Google Scholar

Bacac, M. y col. CD20 Tcb (RG6026), un nuevo anticuerpo biespecífico de células T “2:1” para el tratamiento de neoplasias malignas de células B. Sangre 128, 1836–1836 (2016).

Artículo de Google Scholar

Ahmed, M. y otros. Los anticuerpos biespecíficos que imitan al TCR dirigidos a LMP2A muestran una potente actividad contra las neoplasias malignas del VEB. JCI Insight 3, e97805 (2018).

Mandikian, D. y col. Las afinidades relativas al objetivo de los anticuerpos biespecíficos dependientes de células T determinan la biodistribución en un modelo de ratón con tumor sólido. Mol. Cáncer Ther. 17, 776–785 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mølhøj, M. et al. El anticuerpo biespecífico CD19-/CD3 de la clase BiTE es muy superior al diacuerpo en tándem con respecto a la lisis redirigida de células tumorales. Mol. Inmunol. 44, 1935-1943 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Reusch, U. et al. Un TandAb tetravalente biespecífico (CD19/CD3), AFM11, recluta eficientemente células T para la potente lisis de las células tumorales CD19+. mAbs 7, 584–604 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dushek, O. y col. La potencia del antígeno y la eficacia máxima revelan un mecanismo de activación eficiente de las células T. Ciencia. Señal 44, ra39 (2011).

Google Académico

Moore, PA y cols. Aplicación de moléculas de reorientación de doble afinidad para lograr la destrucción óptima de células T redirigidas del linfoma de células B. Sangre 117, 4542–4551 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hoseini, SS, Guo, H., Wu, Z., Hatano, MN y Cheung, NKV Un potente anticuerpo biespecífico tetravalente que ataca a las células T contra CD33 en la leucemia mieloide aguda. Sangre Avanzada. 2, 1250-1258 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ellerman, D. Participadores biespecíficos de células T: hacia la comprensión de las variables que influyen en la potencia in vitro y la selectividad tumoral y su modulación para mejorar su eficacia y seguridad. Métodos 154, 102-117 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dickopf, S., Georges, GJ y Brinkmann, U. El formato y las geometrías importan: el diseño basado en estructuras define la funcionalidad de los anticuerpos biespecíficos. Computadora. Estructura. Biotecnología. J. 18, 1221-1227 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dreier, T. y col. Respuesta de células T citotóxicas extremadamente potente, rápida e independiente de la coestimulación contra células de linfoma catalizada por un anticuerpo biespecífico monocatenario. En t. J. Cáncer 100, 690–697 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Teplyakov, A., Obmolova, G., Luo, J. y Gilliland, GL La estructura cristalina del correceptor CD19 de células B en complejo con el anticuerpo B43 revela un pliegue inesperado. Proteínas 86, 495–500 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Klesmith, JR, Wu, L., Lobb, RR, Rennert, PD y Hackel, BJ El mapeo fino de epítopos del dominio extracelular CD19 promueve el diseño. Bioquímica 58, 4869–4881 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kügler, M. et al. Estabilización y humanización de un fragmento de anticuerpo Fv monocatenario específico para el antígeno CD19 de linfocitos humanos mediante mutaciones puntuales diseñadas e injerto de CDR en una estructura humana. Ing. Proteínas. Des. Sel. 22, 135-147 (2009).

Artículo PubMed Google Scholar

Ghorashian, S. y col. Expansión mejorada de células T con CAR y persistencia prolongada en pacientes pediátricos con LLA tratados con un CAR CD19 de baja afinidad. Nat. Medicina. 25, 1408-1414 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Meeker, TC y cols. Un antígeno de linfocito B humano único definido por un anticuerpo monoclonal. Hibridoma 3, 305–320 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, Y. et al. Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para CD19. Patente WO 2016/033570 Al (2016).

Amann, M. y col. Ventana terapéutica de MuS110, una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífica para EpCAM murino y CD3 murino. Res. Cáncer. 68, 143-151 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, BM y cols. La afinidad de los ligandos alargados unidos a la membrana determina la potencia de activación del receptor de células T. Frente. Inmunol. 8, 793 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuhn, C. y Weiner, HL Anticuerpos CD3. Inmunoterapia 8, 889–906 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Página, KR et al. Interacción farmacocinética/farmacodinámica temporal entre el anticuerpo monoclonal dirigido al antígeno CD3ε humano otelixizumab y la unión y expresión de CD3ε en cultivo estático de células mononucleares de sangre periférica humana. J. Farmacol. 355, 199–205 (2015).

CAS Google Académico

Chen, X. et al. Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso. Patente WO 2015/095392 Al (2016).

Chen, X., Zaro, JL y Shen, WC Enlazadores de proteínas Fusion: propiedad, diseño y funcionalidad. Adv. Entrega de drogas. Rev. 65, 1357–1369 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N. y Nagamune, T. Diseño de los conectores que separan eficazmente los dominios de una proteína de fusión bifuncional. Ing. Proteínas. 14, 529–532 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Abate, AR, Chen, CH, Agresti, JJ & Weitz, DA Superación de las estadísticas de encapsulación de Poisson mediante ordenamiento cerrado. Chip de laboratorio 9, 2628–2631 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chi, X., Zheng, Q., Jiang, R., Chen-Tsai, RY y Kong, LJ Un sistema para la integración de transgenes en células de mamíferos en un sitio específico. Más uno. 14, e0219842 (2019).

Sadelain, M., Papapetrou, EP y Bushman, FD Puertos seguros para la integración de nuevo ADN en el genoma humano. Nat. Rev. Cáncer 12, 51–58 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Segaliny, AI et al. Detección funcional de células T TCR mediante microfluidos de gotitas unicelulares. Chip de laboratorio 18, 3733–3749 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pipkin, ME, Rao, A. y Lichtenheld, MG El control transcripcional del locus de perforina. Inmunol. Rev. 235, 55–72 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolf, E., Hofmeister, R., Kufer, P., Schlereth, B. y Baeuerle, PA BiTE: construcciones de anticuerpos biespecíficos con actividad antitumoral única. Descubrimiento de drogas. Hoy 10, 1237-1244 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y. et al. Aglutinantes artificiales multiespecíficos rígidamente conectados con geometrías ajustables. Ciencia. Rep. 7, 11217 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stamova, S. y col. Las recombinaciones inesperadas en anticuerpos anti-CD3-anti-CD33 biespecíficos de cadena única pueden evitarse mediante un nuevo módulo conector. Mol. Inmunol. 49, 474–482 (2011).

Lu, D., Jimenez, X., Witte, L. y Zhu, Z. El efecto de la orientación y disposición del dominio variable sobre la actividad de unión al antígeno de un diacuerpo biespecífico humano recombinante. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 318, 507–513 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ding, R. y col. Aislamiento rápido de células B específicas de antígeno mediante microfluidos de gotitas. RSC Avanzado. 10, 27006–27013 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guo, MT, Rotem, A., Heyman, JA y Weitz, DA Microfluidos en gotas para ensayos biológicos de alto rendimiento. Chip de laboratorio 12, 2146–2155 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shembekar, N., Hu, H., Eustace, D. y Merten, CA Detección de microfluidos de gotitas unicelulares para detectar anticuerpos que se unen específicamente a las células diana. Representante celular 22, 2206–2215 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mazutis, L. et al. Análisis y clasificación unicelular mediante microfluidos basados ​​en gotas. Nat. Prot. 8, 870–891 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Gérard, A. et al. Detección y secuenciación de anticuerpos basadas en la actividad unicelular de alto rendimiento mediante microfluidos de gotitas. Nat. Biotecnología. 38, 715–721 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Kiguchi, Y. et al. Perfilado de matrices clonales de fagos que muestran scFv para el descubrimiento de alto rendimiento de mutantes de anticuerpos madurados por afinidad. Ciencia. Rep. 10, 14103 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Inviernos, A. et al. Descubrimiento rápido de anticuerpos de células B individuales utilizando nanopens y luz estructurada. mAbs 11, 1025–1035 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, B. y col. Análisis de alto rendimiento e ingeniería de proteínas mediante matrices de microcapilares. Nat. Química. Biol. 12, 76–81 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, Y. et al. Detección funcional de alto rendimiento para la inmunoterapia contra el cáncer de próxima generación mediante microfluidos basados ​​en gotas. Ciencia. Adv. 7, eabe3839 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones NSF/SBIR (#1913404 y #2051931). Agradecemos a la Dra. Melanie Oaks (instalación de alto rendimiento de UCI Genomics) por sus útiles debates sobre el procesamiento de datos de secuenciación NGS.

Estos autores contribuyeron igualmente: Aude I. Segaliny, Jayapriya Jayaraman, Xiaoming Chen, Jonathan Chong, Ryan Luxon.

Amberstone Biosciences, Inc., Irvine, CA, 92618, EE. UU.

Aude I. Segaliny, Xiaoming Chen, Jonathan Chong, Ryan Luxon, Audrey Fung, Qiwei Fu, Xianzhi Jiang, Rodrigo Rivera, Xiaoya Ma, Ci Ren, Yonglei Shang y George Wu

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Jayapriya Jayaraman, Per Niklas Hedde y Weian Zhao

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Jan Zimak y Weian Zhao

Centro de Investigación de Células Madre Sue y Bill Gross, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Weian Zhao

Centro Oncológico Integral de la Familia Chao, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Weian Zhao

Centro Edwards de Ciencias de la Vida para Tecnología Cardiovascular Avanzada, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Weian Zhao

Departamento de Química Biológica, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Weian Zhao

Instituto de Inmunología, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Weian Zhao

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

AS, YS, GW y WZ diseñaron el estudio. XC, PNH, JC y QF desarrollaron el sistema de microfluidos de gotas. YS, GW, AS, JZ y JJ diseñaron la biblioteca BiTE CD19xCD3. JJ, JZ y XJ generaron la biblioteca de ADN; JJ y AS diseñaron la biblioteca de células de mamíferos, células CD19+ y Blinatumomab+. JC, AF, XC y AS realizaron los experimentos de adición. JC, AF, XC, QF y AS realizaron el experimento de detección de bibliotecas. RL y JJ hicieron el análisis posterior (scPCR, recuperación y ensamblaje de ADN para expresión, análisis de secuencia, expresión a pequeña escala). JJ y AS realizaron las validaciones funcionales de los clones clasificados y JJ realizó el análisis de secuencia. AF y RR expresaron y purificaron los BiTE. AS, XM y CR realizaron los ensayos primarios de células T para la validación de BiTE ordenada. AS, JJ, XC, GW y WZ analizaron los datos y escribieron el artículo.

Correspondencia a George Wu o Weian Zhao.

WZ es cofundador de Amberstone Biosciences, Inc., y cofundador y director de Aureka Biotechnologies, Inc. Los autores restantes no declaran intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Anam Akhtar.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Segaliny, AI, Jayaraman, J., Chen, X. et al. Un proceso de descubrimiento de anticuerpos biespecíficos de alto rendimiento. Común Biol 6, 380 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04746-w

Descargar cita

Recibido: 20 de febrero de 2023

Aceptado: 22 de marzo de 2023

Publicado: 07 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04746-w

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.