Una nueva red de proteínas de la cápside permite la estructura característica de la membrana interna de los virus gigantes Marseilleviridae

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21428 (2022) Citar este artículo

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Marseilleviridae es una familia de virus gigantes que muestran una membrana interna característica con extrusiones debajo de los vértices icosaédricos. Sin embargo, objetos tan grandes, con un diámetro máximo de 250 nm, son técnicamente difíciles de examinar con una resolución subnanométrica mediante microscopía crioelectrónica. Aquí, probamos la utilidad del crio-EM de alto voltaje (crio-HVEM) de 1 MV para el análisis estructural de partículas individuales (SPA) de virus gigantes utilizando tokiovirus, una especie de Marseilleviridae, y revelamos la estructura de la cápside con una resolución de 7,7 Å. La cápside que encierra el ADN viral constaba principalmente de cuatro capas: (1) proteínas de la cápside mayor (MCP) y proteínas pentonas, (2) proteínas de la cápside menor (mCP), (3) componentes proteicos de andamio (ScPC) y (4) componentes internos de la cápside. membrana. Las mCP mostraron una nueva red de cápside que consta de ocho componentes proteicos. Las ScPC que conectan los vértices icosaédricos apoyaron la formación de extrusiones de membrana y posiblemente actúen como proteínas de cinta métrica reportadas en otros virus gigantes. Se sugirió que la densidad sobre el trímero MCP incluyera glicoproteínas. Este es el primer intento de crio-HVEM SPA. Descubrimos que las principales limitaciones son la falta de adquisición automatizada de datos y soporte de software para la recopilación y el procesamiento y, por lo tanto, una resolución alcanzable. Sin embargo, los resultados allanaron el camino para el uso de crio-HVEM para el análisis estructural de muestras biológicas más grandes.

Los “virus gigantes” son virus de tamaño físico excepcionalmente grande, más grandes que las bacterias pequeñas1. También tienen un genoma mucho más grande (> 100 kilobases (kb)) que otros virus y contienen muchos genes (> 50 genes) que no se encuentran en otros virus2. Una de las características de estos virus es que poseen ADN bicatenario encapsulado en una bicapa lipídica3. Estos grandes virus de ADN ahora se clasifican taxonómicamente en el filo Nucleocytoviricota4, pero históricamente se los ha denominado virus de ADN grande nucleocitoplásmico (NCLDV). Los NCLDV son un clado expansivo de virus grandes que poseen ADN bicatenario y se dirigen a diversos eucariotas hospedadores5. Los NCLDV están compuestos por varias familias, incluidas Asfarviridae, Ascoviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Phycodnaviridae y Poxviridae, y virus no clasificados como cedratvirus, faustovirus, medusavirus, Mininucleoviridae, mollivirus, orfeovirus, pacmanvirus, pandoravirus y pithovirus6. Incluso ahora, se aíslan y estudian una variedad de NCLDV en todo el mundo. Se ha propuesto un nuevo orden, Megavirales, basado en las características compartidas de estos virus7. Los NCLDV exhiben varios tipos de formas dependiendo de la especie2. Asfarviridae, Ascoviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Phycodnaviridae, faustovirus, medusavirus, pacmanvirus y Mininucleoviridae exhiben una forma icosaédrica. Poxviridae presenta forma de ladrillo. Los cedratvirus, mollivirus, orfeovirus, pandoravirus y pithovirus presentan forma de ánfora. Los tamaños también varían; Los pitovirus con forma de ánfora son los más grandes de los virus gigantes, superando los 2 μm de tamaño, pero existe una variación significativa en las dimensiones reales8. Por otro lado, el mimivirus con forma icosaédrica tiene ~ 500 nm de diámetro (sin incluir los filamentos fibrosos que se extienden desde la cápside)9, y su pariente más cercano conocido, el cafeteriavirus, tiene ~300 nm10. Los poxvirus con forma de ladrillo miden aproximadamente 350 × 270 nm, aunque las dimensiones precisas son variables11. Otros virus icosaédricos son ~ 260 nm para medusavirus12,13, ~ 180 nm para iridovirus14, ~ 190 nm para PBCV-115. El ASFV mide ~250 nm, pero es complicado porque tiene una membrana externa16.

Marseilleviridae es una familia del nuevo orden de NCLDV17, que tiene un genoma altamente complejo de ~ 360 kb y un tamaño de partícula de ~ 250 nm. El primer miembro, el virus de Marsella, fue aislado en 2007 mediante el cultivo de una muestra de agua de una torre de refrigeración en París, Francia18. Actualmente, el virus Cannes 8, Melbournevirus, Marseillevirus, Tokyovirus, Port-Miou virus, Lausannevirus, Noumeavirus, Insectminevirus, Tunisvirus, Marseillevirus brasileño, Marseillevirus del mejillón dorado y más especies pertenecen a esta familia, y estos se clasifican en cinco linajes, del A al E19,20. Varios estudios también han reportado la presencia de Marseilleviridae en humanos21,22,23,24. Sin embargo, existe controversia en torno a las infecciones por el virus de Marsella en humanos, ya que otros estudios no han demostrado evidencia alguna25,26. El virus Melbourne, uno de los Marseilleviridae perteneciente al linaje A27, ha sido analizado previamente mediante análisis de partículas individuales (SPA) con microscopía crioelectrónica (crio-EM) con una resolución de 26 Å28. Muestra la cápside icosaédrica con un número de triangulación de T = 309, muestra la membrana interna característica dentro de la cápside que sobresale justo debajo de los vértices y el cuerpo único de gran densidad dentro del nucleoide. Tokyovirus es el primer Marseilleviridae aislado en Asia en 2016 y está clasificado en el linaje A29. En este estudio se utilizó Tokyovirus para investigar la estructura característica de la cápside del icosaédrico Marseilleviridae.

Pocos estudios han revelado en detalle la estructura de la cápside de los grandes virus icosaédricos. Un estudio de microscopía electrónica hace medio siglo mostró que la gran cápside del virus icosaédrico está compuesta por 20 y 12 conjuntos de trisimetron y pentasimetron, respectivamente30,31, aunque estos virus no están clasificados como NCLDV. Cada uno de ellos es un grupo de capsómeros formados por pseudohexámero. En los últimos años, las estructuras de muchos virus se han revelado con alta resolución mediante el uso de crio-EM SPA para determinar la estructura general32, la dinámica33,34 y el ensamblaje35. Sin embargo, los grandes virus icosaédricos presentan desafíos especiales para la crio-EM de alta resolución simplemente por su tamaño, lo que impone límites estrictos a la preparación de muestras, la adquisición de datos y las técnicas de reconstrucción de imágenes. Un límite estricto es aquel que no se puede superar utilizando las mismas condiciones, por ejemplo: el recuento de partículas por micrografía o el límite de resolución impuesto por la frecuencia de Nyquist. Un límite suave puede superarse, por ejemplo, recopilando más micrografías, pero un límite estricto no. Por lo tanto, inicialmente se combinaron varios métodos diferentes, incluida la tomografía crioelectrónica, la microscopía electrónica de barrido y la microscopía de fuerza atómica, con crio-EM e investigaron la estructura de virus gigantes9,36. Los diferentes métodos que se han utilizado para investigar virus gigantes han sido examinados anteriormente37. Sin embargo, en 2019, la estructura del virus 1 de Paramecium bursaria chlorella (PBCV-1) con una resolución de 3,5 Å15 y la estructura del virus de la peste porcina africana (ASFV) con una resolución de 4,1 Å16 se informaron mediante el uso de crio-EM SPA, respectivamente. Estos SPA crio-EM de los grandes virus icosaédricos de alta resolución se han utilizado comúnmente en microscopios con un voltaje de aceleración de 300 kV. Sin embargo, estos informes utilizan un método llamado “reconstrucción basada en bloques”38 para lograr estas resoluciones que se centra en subsecciones (“bloques”) del virus para permitir un refinamiento del desenfoque localizado, lo que da como resultado reconstrucciones de mayor resolución. En estos informes, se demostró que las cápsides de PBCV-1 y ASFV están compuestas por una proteína de cápsida "principal" (MCP) y catorce tipos combinados (PBCV-1) o cuatro tipos (ASFV) de proteína de cápsida "menor". (mCP), respectivamente. El MCP de PBCV-1 y ASFV incluye motivos dobles en forma de “rollo de gelatina”, cada uno de los cuales consta de ocho hebras β39. Los bucles de conexión en los motivos y sus sitios de glicosilación proporcionan a estos virus funciones únicas. Los mCP forman una red hexagonal para llenar el espacio entre los trímeros de MCP pseudohexagonales, que contribuyen a mantener estable la estructura de la cápside. Además, PBCV-1 y ASFV poseen una mCP llamada proteína "cinta métrica", que es una proteína filamentosa larga que se extiende desde un pentasimmetron hasta un pentasimmetron adyacente a lo largo del borde del trisimmetron. Se propuso que la longitud de esta proteína de cinta métrica determina el tamaño de la cápsida40.

Aquí nos centramos en la reconstrucción de una sola partícula de todo el tokiovirus utilizando crio-HVEM (microscopía electrónica de alto voltaje) de 1 MV. HVEM se desarrolló originalmente para ampliar la resolución alcanzable utilizando longitudes de onda de electrones más cortas41. Actualmente, el uso principal se centra en muestras gruesas, en las que los voltajes de aceleración más bajos no pueden penetrar42. No se ha informado anteriormente sobre crio-HVEM en muestras biológicas para el análisis de partículas individuales, y solo se han informado unos pocos ejemplos utilizando tomografía8,43,44. Para muestras gruesas (por ejemplo, tokiovirus con un diámetro máximo de 250 nm), la influencia de la profundidad de campo provoca un cambio de enfoque interno, imponiendo un límite estricto a la resolución alcanzable45. Sin embargo, aumentar el voltaje de aceleración (acortando la longitud de onda de los electrones emitidos) puede aumentar la profundidad de campo y mejorar las condiciones ópticas (de los electrones) en muestras gruesas. La resolución que se puede lograr con un voltaje de aceleración determinado se puede calcular simplemente mediante la siguiente fórmula, asumiendo que todos los puntos dentro de un espesor determinado se pueden considerar igualmente enfocados:

donde d es la resolución, t es el espesor de la muestra (en este caso, el diámetro de la partícula) y λ es la longitud de onda del electrón45. Para muestras de alta simetría, como los virus icosaédricos, el espesor (o profundidad) de la muestra es funcionalmente equivalente al diámetro de la partícula. Usando la ecuación. (1), para una muestra de 250 nm de espesor, a un voltaje de aceleración de 300 kV, la longitud de onda del electrón es 1,97 pm, por lo que el límite de resolución teórico es ~ 9,9 Å con todo el ancho de la partícula a la misma profundidad focal (curvas negras en la figura 1). Ampliando esto, a un voltaje de aceleración de 1 MV, la longitud de onda del electrón es 0,87 pm, por lo que se calcula que el límite de resolución teórico mejora a 6,6 Å.

El efecto de profundidad de campo en crio-EM. Los límites de resolución teórica causados por el tamaño de las partículas (Ec. 1) se trazan a voltajes de aceleración de 200, 300 y 1000 kV, suponiendo un desenfoque uniforme (curvas negras). Las resoluciones en las que el error de fase limita la resolución máxima teórica de una reconstrucción crio-EM (Ec. 2) se trazan a voltajes de aceleración de 200 kV, 300 kV y 1000 kV (curvas rojas). Línea vertical discontinua dibujada en el diámetro máximo (250 nm) del tokiovirus. Los límites de resolución teóricos para el diámetro máximo del tokiovirus se muestran con un decimal.

Considerar el error de fase en la función de transferencia de contraste (CTF) de la señal46 es otra estimación para calcular la resolución máxima alcanzable (curvas rojas en la Fig. 1), y se puede calcular mediante:

En este caso, las resoluciones alcanzables se mejoran a 5,9 Å a 300 kV y 4,0 Å a 1 MV, respectivamente (curvas rojas en la Fig. 1). Sin embargo, el valor de 0,7 en la ecuación. (2)46 puede variar según la forma de un objeto, ya sea que esté lleno o vacío, y no se ha probado en objetos reales como el tokiovirus (diámetro máximo de 250 nm). Discusiones anteriores47,48,49 cubren las ecuaciones para calcular longitudes de onda de electrones y tener en cuenta los efectos relativistas en voltajes de aceleración dados si uno desea explorar más a fondo las matemáticas. Por supuesto, muchos otros factores afectan la resolución máxima lograda con datos experimentales. A partir de la estimación, intentamos aclarar la estructura de toda la partícula de virus gigante con un diámetro máximo de 250 nm a mayor resolución utilizando un crio-HVEM de 1 MV en lugar de utilizar el enfoque basado en bloques.

En este estudio, primero evaluamos 1 MV crio-HVEM para SPA biológico. Luego llevamos a cabo SPA para un virus gigante icosaédrico de diámetro máximo de 250 nm, tokyovirus. Esto resultó en una reconstrucción tridimensional (3D) de 7,7 Å sin utilizar la técnica de reconstrucción basada en bloques. El mapa crio-EM reveló una nueva red de proteínas de la cápside (Fig. 4). Consistía en trímeros de MCP y proteínas pentonas que cubrían la superficie, una capa de mCP que constaba de ocho componentes proteicos y una red de componentes proteicos de andamio (ScPC). La proteína pentona es una proteína pentamérica única ubicada en la misma capa que el MCP, pero solo en los cinco vértices. Los ScPC que existen debajo de la capa de mCP y que conectan cada vértice permiten la extrusión de la membrana interna. Como tales, pueden desempeñar un papel similar al de las proteínas con cinta métrica que determinaron el tamaño de las partículas en el NCLDV. Una densidad adicional encima del trímero MCP sugirió incluir una glicoproteína, y que puede funcionar para la interacción entre la célula huésped. Nuestros resultados allanan el camino para una mayor comprensión de esta familia de NCLDV y, además, proporcionan la primera evaluación de una nueva herramienta para la SPA de especímenes biológicos gigantes.

Si bien el límite de resolución teórico impuesto se supera al pasar a voltajes de aceleración más altos (Fig. 1)45,46, es de poca utilidad práctica si otros factores imponen límites estrictos a la resolución alcanzable. Con este fin, examinamos el rendimiento del crio-HVEM de 1 MV (JEOL JEM-1000EES) utilizando una película de Pt-Ir y realizamos un promedio rotacional en un espectro de potencia calculado (Fig. 2A). En el gráfico de intensidad 1D, los anillos de Thon son claramente visibles a 1,81 Å (Fig. 2B). Comparar el rendimiento del crio-HVEM de 1 MV equipado con un cañón de electrones LaB6 con un microscopio de alto rendimiento de 300 kV que utiliza un cañón de electrones de emisión de campo térmico (en este caso se utilizó un Titan Krios G2 (Thermo Fisher Scientific)) también es de gran utilidad. interés (Fig. S1). Ambos utilizan el detector directo Gatan K2 Summit como cámara. La función de transferencia de modulación (MTF) del microscopio de 1 MV es superior en el modo de conteo en todo el rango de frecuencia espacial en comparación con la del microscopio de 300 kV, aunque en el modo de súper resolución cae significativamente dentro de la frecuencia de Nyquist de 0,25 (Fig. S1A). . La eficiencia cuántica detectivesca (DQE) es igualmente superior para el microscopio de 1 MV en el modo de conteo, pero en el modo de súper resolución muestra una reducción significativa en los microscopios de 1 MV y 300 kV (Fig. S1B). Además, el DQE del crio-HVEM de 1 MV muestra una caída de hasta un 40% en el rendimiento en las frecuencias espaciales más bajas en comparación con el crio-EM de 300 kV. Más allá de la frecuencia de Nyquist de 0,6, los dos son comparables. Sin embargo, en este estudio se tuvo que utilizar el modo de superresolución para aumentar la eficiencia del muestreo manual de las partículas de virus de gran tamaño (Tabla 1).

Rendimiento del crio-HVEM (JEOL JEM-1000EES) equipado con un detector de electrones directo Gatan K2 Summit utilizando una muestra estándar de Pt-Ir. (A) Espectro de potencia que muestra anillos de Thon claros. (B) Una vista enfocada de los anillos de Thon. (C) Gráfico 1D del espectro de potencia calculado con el complemento "Radial Profile Extended" de Fiji75.

La Figura 3 muestra la estructura general del tokiovirus reconstruida utilizando RELION 3.150 con simetría icosaédrica impuesta. El tokiovirus tiene una cápside exterior compuesta de trímeros MCP dispuestos en forma icosaédrica con T = 309 (h = 7, k = 13) (Fig. 3A). Inmediatamente debajo de la capa exterior (MCP) hay capas de mCP y ScPC en ese orden, y la membrana interna almacena el nucleoide viral dentro de estas capas de la cápside (Fig. 3B-D). En la extrusión de la membrana interna, la membrana forma múltiples capas (asterisco en la Fig. 3C). La proximidad al vértice de la cápside desde esta extrusión se realiza a través de mCP relativamente grandes y materiales de baja densidad (flecha en la Fig. 3C). En comparación con MCP y mCP, las densidades de las ScPC están manchadas, lo que muestra la flexibilidad estructural del componente (Fig. 3C, D). La Figura 3E muestra la resolución local estimada de la capa de la cápside del tokiovirus, cortada para visualización interna. La resolución más alta se mostró en la interfaz entre MCP y mCP. Cada parte tiene una estructura característica, que puede verse mejor filtrando y segmentando cuidadosamente la reconstrucción (Fig. 4). Los trímeros de MCP cubren toda la superficie de la cápside viral excepto los cinco vértices (azul claro en la Fig. 4A), donde los pentones tapan el agujero en los vértices (pentón en la Fig. 4A). Los mCP se pueden clasificar aproximadamente según ocho componentes distintos, que hemos denominado temporalmente pegamento, cremallera, celosía, cemento, soporte y componente pentasimómetro (PC) -α, β y γ (Fig. 4B). Además, los ScPC están ubicados debajo de los mCP (amarillo en la Fig. 4). Estos componentes proteicos pueden consistir en varias proteínas mCP. Con la resolución actual, y dadas las anotaciones actuales del genoma, no es posible segmentar cada proteína o identificar cada proteína según su masa. Acabamos de identificar estos componentes proteicos por sus formas y ubicaciones. A diferencia de los otros mCP, los ScPC forman una matriz encadenada antiparalela entre pentasimómetros a lo largo de la interfaz trisimómetro (amarillo en la Fig. 4). Posiblemente como resultado de los marcos de los ScPC, la membrana interna tiene una estructura característica que sobresale hacia afuera debajo de los cinco vértices (Fig. 3B, C, gris en la Fig. 4).

Reconstrucción SPA 3D de tokiovirus con una resolución de 7,7 Å. (A) Una vista de isosuperficie, coloreada por radio, y que muestra los ejes de simetría quíntuple (pentágono negro), triple (triángulo negro) y doble (doble lágrima negra). Se incluyen índices H, K que indican el icosaedro T = 309. (B) Una vista en sección transversal, con ejes de simetría mostrados con flechas. (A,B) están coloreados por radio en UCSF Chimera con los siguientes parámetros: azul, 910 Å; turquesa, 1010 Å; verde, 1080 Å; amarillo, 1125 Å; rojo, 1200 Å y se muestran en 2 σ. (C) Un corte central de la reconstrucción 3D. Asterisk muestra una estructura multicapa en la extrusión de la membrana interna. La flecha indica densidades débiles que conectan el vértice de la cápside y la extrusión de la membrana interna. (D) Vista enfocada del cuadro marcado en (C), que muestra la delimitación entre la proteína de la cápside mayor (MCP), la proteína de la cápside menor (mCP), el componente de proteína de andamio (ScPC), la membrana interna (IM) y la nucleocápside (NC). (E) resolución local de la cápside, estimada por el módulo blocres de Bsoft71, centrándose en el borde superior de la cápside, cortada para permitir la visualización de la densidad interna y se muestra a 3 σ. Barras de escala: (A – C) 50 nm, (D, E) 10 nm.

Segmentación de la estructura del tokiovirus. (A) El virión completo del tokiovirus recortado para mostrar cada componente. Componentes individuales del virión; Se indican la capa de proteína de la cápside principal (MCP) (azul claro), la capa de proteína de la cápside menor (mCP) (azul), la matriz del componente de proteína de andamio (ScPC) (amarillo) y la membrana interna (IM) (gris). Los segmentos individuales reciben un filtro de paso bajo para mejorar la claridad de la visualización. (B) Segmentación enfocada de mCP, ScPC (amarillo) y pentón (rojo púrpura) de tokiovirus. Los mCP, de color azul en (A), se clasificaron en 8 componentes según las estructuras, que consistían en un componente de red (LtC) (de naranja a rojo), un componente de soporte (SuC) (azul real), un componente de cemento (CmC) (cielo). azul), componente de cremallera (ZpC) (rosa), componente de pegamento (GlC) (verde esmeralda) y 3 componentes de pentasimmetron (PC-α, β y γ) (púrpura, verde claro y cian). La isosuperficie se muestra en 2 σ.

Segmentamos la reconstrucción del tokiovirus y luego extrajimos y clasificamos las mCP en ocho tipos de componentes proteicos según sus características y disposiciones estructurales (Fig. 4B). Se les conoce como componente de celosía (LtC) (de naranja a rojo en la Fig. 4B), componente de soporte (SuC) (azul real en la Fig. 4B), componente de cemento (CmC) (azul cielo en la Fig. 4B), componente de cremallera. (ZpC) (rosa en la Fig. 4B) y componente de pegamento (GlC) (verde esmeralda en la Fig. 4B), y tres componentes pentasimómetron de α, β y γ (PC-α, β y γ) (púrpura, verde claro y cian en la Fig. 4B), respectivamente. El triángulo en forma de malla formado por los mCP se compone de tres unidades trapezoidales que constan de cinco componentes, LtC, SuC, ZpC, CmC y GlC, y estos trapecios están conectados girando 120 ° alrededor de los tres ejes de rotación. Estos componentes proteicos están conectados además a PC-β y PC-γ en el borde del triángulo.

El LtC (de naranja a rojo en la Fig. 4B) forma una estructura ondulada a lo largo del espacio de los trímeros de MCP (de naranja a rojo en la Fig. 4B). Esta forma de onda se repite según la cantidad de trímeros MCP presentes encima de cada uno. Forma la base de la unidad trapezoidal. Bajo la estructura de red formada por LtC, el SuC (azul real en la Fig. 4B) crea un puente entre varios LtC (Fig. 4B). También conecta los dos pares de ScPC (amarillo en la Fig. 5C) alrededor de las extrusiones de la membrana, formando una estructura de ScPC tridimensional que rodea la membrana interna (Fig. 5C). Dentro del trisimómetro, los CmC (azul cielo en la Fig. 4B) conectan las tres unidades trapezoidales interconectando los extremos de los LtC, extendiéndose desde el eje triple hacia el pentasimómetro asociado y terminando en el borde ScPC. Dos componentes proteicos, ZpC y GlC (rosa y verde esmeralda en la Fig. 4B), participan en la conexión de trisimetrones adyacentes y se ejecutan directamente sobre la matriz ScPC (Fig. 5A, B). Los GlC están presentes en el límite entre trisimetrones adyacentes y parecen pegarlos. Los ZpC llenan los espacios entre los LtC en las interfaces trisimetron, entrelazándose con los GlC como los dientes de una cremallera.

Examen de la red de componentes proteicos del armazón entre la membrana interna y la cápside. (A) Densidad de losa de la cápside de tokyovirus a lo largo de la interfaz trisimómetro que muestra la capa más interna de la red mCP. Las flechas indican densidades débiles que conectan el vértice de la cápside y la extrusión de la membrana interna. (B) Vista de isosuperficie de los componentes de mCP coloreados como en la Fig. 4 (GlC; verde, ZpC; rosa intenso, ScPC; amarillo, SuC; azul real) y con las distancias desde la membrana interna a los componentes indicadas por flechas. (C) La membrana interna del tokiovirus con la red ScPC (amarillo) y SuC (azul real) superpuesta. (D) Centrándose en el pentasimómetro en el eje quíntuple, que representa las distancias desde la extrusión de la membrana interna hasta PC-α, β, γ (púrpura, verde claro y cian) y el pentón (rojo púrpura). La isosuperficie se muestra en 2 σ.

El ScPC está presente más dentro de la capa de mCP (amarillo en las figuras 4, 5), formando una estructura que rodea la membrana interna. ScPC tiene una estructura de cabeza grande y cola larga, que está dispuesta a lo largo del borde del trisímetro (Figs. 4 y 5B, C). Dos ScPC están conectados de manera antiparalela con la cabeza y la cola, y ambas cabezas están ubicadas en el vértice del pentágono del pentasimómetro, rodeando la extrusión de la membrana (Fig. 5C). Los pares de terminales ScPC adyacentes están conectados por SuC (azul real en la Fig. 5C).

La densidad de pentonas (región central en la Fig. S2A) es similar a la de PBCV-1 (Fig. S2B), en el sentido de que tiene una región de "tapa" que se alinea con la capa de MCP y una región inferior que se alinea con la capa de mCP. . Al ASFV, en comparación, le falta esta región inferior (Fig. S2C). Ajustamos el modelo PDB de la pentona PBCV-1 (Fig. S2E) a la región superior de la pentona de tokyovirus (Fig. S2D), mostrando que la pentona de tokyovirus tiene un volumen y una estructura similares a los de la pentona de PBCV-1, aunque el homólogo La proteína de la pentona PBCV-1 no ha sido identificada en tokiovirus. En ASFV, el dominio de inserción es extrínseco de la interfaz MCP (soporte en la figura S2F), mientras que ni el tokiovirus ni el PBCV-1 exhiben una densidad clara para este dominio. Este dominio de inserción aparece en ASFV. Puede funcionar para ayudar a la inserción de ADN en la cápside, ya que el VPPA también tiene una membrana externa para penetrar16. Este dominio también está presente en el mavirus dependiente del Cafeteriavirus (un virus que infecta un NCLDV específico)51. La densidad de pentonas, incluida la región inferior, tiene una distancia a la extrusión de la membrana interna de ~ 150 Å (Fig. 5D). La brecha se sostuvo con tres componentes pentasimómetron (PC-α, β y γ) y materiales de menor densidad (flecha en la Fig. 3C).

Los tres componentes pentasimómetro de PC-α, β y γ mantienen una distancia similar de la extrusión de la membrana interna (54–60 Å) (Fig. 5D), que también es similar a la de la matriz ScPC a lo largo de la interfaz trisimómetro (42 Å) (amarillo en la Fig. 5B). PC-α (púrpura en las Figs. 4B y 5D) es el más grande e interactúa entre sí y con el pentón mismo (Figs. 4B y 5D). Los pares de PC-β y PC-γ (verde claro y cian en las figuras 4B y 5D) rodean este grupo de PC-α. PC-β interactúa principalmente con una única PC-α, al mismo tiempo que actúa como terminal para el GlC (Fig. 4B). PC-γ interactúa con dos copias vecinas de PC-α. Estos componentes proteicos funcionan para soportar la matriz MCP en el pentasimómetro. También mantienen contacto con la red mCP debajo del trisimómetro e interactúan con la extrusión de la membrana interna a través de materiales de baja densidad mal resueltos debajo de los cinco vértices.

Se informó por primera vez que el virus Melbourne, uno de Marseilleviridae, posee una extrusión muy característica de la membrana interna en los cinco ejes28. El tokiovirus también muestra esta extrusión de la membrana interna y, además, permitió la identificación de múltiples capas en la extrusión (asterisco en las figuras 3C y 5A, B, D). Curiosamente, las grandes cabezas del ScPC rodean la extrusión de la membrana junto con las SuC (Fig. 5C). La matriz ScPC y las SuC pueden desempeñar un papel en la distorsión de la membrana en esta forma extruida en los cinco ejes.

Se realizó una búsqueda BLAST52 utilizando la secuencia MCP propuesta del borrador del genoma del tokiovirus29 (Tabla 2). El MCP de tokiovirus muestra las puntuaciones más altas frente a iridovirus (PDBID: 6OJN)14 y PBCV-1 (PDBID: 5TIP)53, con cobertura alta y homología moderada, aunque ambas comparaciones de secuencias conservadas caen por debajo de las "identidades" que permiten la comparación directa. y comparaciones seguras54. Las tres secuencias de aminoácidos de MCP respectivas fueron alineadas por PROMALS3D55. PSIPRED56 predijo de forma independiente la estructura secundaria del MCP del tokiovirus, que identificó dos conjuntos de ocho cadenas β (B1 a I2 en la Fig. S3) que forman un motivo de rollo de gelatina (doble) como el MCP de otros NCLDV7.

En la secuencia de aminoácidos de MCP de cada virus, existe una gran diferencia en la longitud del bucle entre las cadenas β (Fig. S4). Para investigar cómo aparece la diferencia en la longitud del bucle en la diferencia en la estructura de MCP, se generó un modelo de homología de MCP de tokiovirus basado en el modelo de MCP de PBCV-1 utilizando el servidor SWISSMODEL57. Se extrajo el trímero MCP de un eje triple del mapa crio-EM de tokiovirus (Fig. 6A). Luego, el modelo de homología se optimizó manualmente para ajustarse a la densidad de MCP usando COOT58 y se minimizó energéticamente con PHENIX59 para garantizar que la estructura sea válida (Fig. 6B). El modelo de homología resultante se comparó con ambos modelos MCP de PBCV-1 e iridovirus (Fig. S4). En el tokyovirus MCP, los bucles que conectan las partes externas del rollo de gelatina 1 (JR1) o JR2 son más largos que los del PBCV-1. Los bucles DE1 y FG1 son más largos que los de PBCV-1 y de longitud similar a los de iridovirus. El bucle HI1 está particularmente extendido (Figs. S3 y S4), siendo la secuencia de 23 residuos del tokiovirus más larga que la del PBCV-1. Por el contrario, el bucle DE2 en el tokiovirus está truncado en comparación con los del PBCV-1 y el iridovirus. Otros bucles tienen una longitud comparable. Estos bucles que constituyen la parte externa del modelo MCP coinciden con la parte externa de la densidad del trímero MCP de tokyovirus, pero no llenan toda la densidad de la tapa del trímero MCP de tokyovirus (Fig. 6B). La densidad en el MCP del tokiovirus que no está llena con el modelo de homología ajustado se ha resaltado en rojo (Fig. 6C).

Mapa crio-EM y modelo de homología ajustado del trímero MCP del tokiovirus. El modelo de homología fue generado por SWISS-MODEL57 y ajustado al volumen con COOT58 y refinado con PHENIX59. (A) Vistas lateral y superior del mapa crio-EM extraído del trímero MCP. (B) Vistas lateral y superior del mapa crio-EM de trímero MCP extraído con el modelo de homología instalado. (C) Vistas lateral y superior del mapa crio-EM MCP extraído del trímero MCP con la región de tapa adicional coloreada en rojo. La barra de escala equivale a 2 nm. La isosuperficie del segmento MCP extraído se muestra en 2 σ.

La densidad de MCP tiene una tapa visible (roja en la Fig. 6C) que no corresponde a ninguna parte del modelo de homología ajustado. Para comprobar esto, extrajimos tres MCP de diferentes áreas de la cápside: una del propio eje triple, una de dos trímeros de MCP alejados del eje triple y uno de un punto intermedio entre los ejes dos, tres y cinco. La correlación cruzada directa entre estos osciló entre 0,99 y 0,91 cuando se calculó en UCSF Chimera60. Todos los trímeros MCP poseen esta densidad de capa. Un informe anterior28 sobre virus de Marsella mostró que una pequeña proteína indicada por análisis proteómico estaba presente en aproximadamente los mismos niveles que la proteína MCP. Sin embargo, debido a la naturaleza de SPA (la de promediar muchas partículas) y la imposición de simetría icosaédrica, es posible que no todos los MCP estén completamente ocupados. La correlación de la densidad de la tapa varía de 0,98 (la densidad de la tapa triple contra la densidad de la tapa triple simetrizada) a 0,87 y 0,84 para las otras dos posiciones de MCP, respectivamente. Esta menor correlación para la densidad de la capa puede deberse a una mayor flexibilidad, lo cual es probable si la proteína está altamente glicosilada. La naturaleza simétrica de este límite implica la presencia de proteína en lugar de una glicosilación postraduccional desordenada de la MCP. Esto se ve respaldado además por la tinción con ácido periódico de Schiff (PAS)61 de proteínas de tokiovirus separadas por SDS-PAGE, que no muestran ninguna proteína glicosilada en el peso molecular de la MCP. Sin embargo, es evidente una banda a ~ 14 kDa (Fig. S5), lo que indica que es probable que la densidad de la capa incluya una proteína que ha sido glicosilada interactuando con la parte superior de la MCP.

Aquí aplicamos crio-HVEM de 1 MV al análisis estructural del tokiovirus como una partícula viral completa, superando algunos de los límites de resolución impuestos por el efecto de la profundidad de campo en partículas excepcionalmente grandes. La reconstrucción 3D mostró la resolución más alta de un virus gigante de más de 200 nm sin utilizar la técnica de reconstrucción basada en bloques38 o métodos similares16. Sin embargo, la resolución actual de 7,7 Å del tokiovirus no ha alcanzado el máximo teórico de 4,0 Å para partículas de ~ 250 nm (curva roja en la Fig. 1). En la práctica, muchos factores afectan la capacidad de lograr una resolución determinada más allá del voltaje de aceleración. Por lo tanto, antes de estudiar la muestra biológica, se confirmó el rendimiento del sistema de microscopio con anillos Thon de una película estándar de Pt-Ir que se extendía más allá de 2 Å (Fig. 2). Esto demuestra que el microscopio o la fuente de electrones no sería un factor limitante en las resoluciones logradas con las partículas gigantes del virus, aunque no tenga una fuente de electrones de emisión de campo y esté utilizando una fuente de LaB6 menos coherente.

Aunque hubo muchos factores que limitaron la resolución del tokiovirus a 7,7 Å, el principal factor limitante para la resolución actual es probablemente la cantidad de datos que se pueden recopilar. Cryo-HVEM requiere la recolección manual de micrografías. Las 1.182 partículas de 160 micrografías utilizadas en total fueron un número extremadamente pequeño en comparación con otros SPA informados de virus gigantes utilizando microscopios de 300 kV. El PBCV-1 con un diámetro máximo de 190 nm se reconstruyó con ~ 13.000 partículas de 5624 imágenes en una reconstrucción de 4,4 Å15 y el ASFV con un diámetro máximo de 250 nm de la cápside externa se reconstruyó con 16.266 partículas de 17.135 micrografías en una reconstrucción de 14,1 Å62, y con 63.348 partículas de 64.852 micrografías con reconstrucción de 8,8 Å16. El tamaño del virus impone límites que requieren un equilibrio cuidadoso entre un aumento más bajo para aumentar las partículas fotografiadas por micrografía y un aumento lo suficientemente alto como para lograr resoluciones que valga la pena en las reconstrucciones. El tokyovirus con un diámetro máximo de 250 nm es tan grande que incluso con aumentos relativamente bajos, en el mejor de los casos había alrededor de 12 partículas de virus por micrografía (a menudo ~ 6 partículas de virus, por ejemplo, en la Fig. S6A) que pueden utilizarse para la clasificación 2D. En este caso, se utilizó el modo de "superresolución" (dimensiones del detector de 7420 × 6780) en la cámara K2 Summit para la adquisición de datos, manteniendo el espacio entre píxeles a menos de 1,5 Å/píxel (Tabla 1). La adquisición automatizada de micrografías, que ahora es casi omnipresente en la crio-EM convencional, aumentaría en gran medida la cantidad de datos que se pueden adquirir en un período de tiempo determinado. Sin embargo, seleccionamos el modo de "súper resolución" para crio-HVEM operado manualmente para mantener un mejor recuento de partículas (por micrografía) mientras mantenemos una frecuencia de muestreo más alta, aunque el rendimiento del detector se ve ligeramente afectado (Fig. S1). Probablemente esto imponga una mayor limitación a la resolución alcanzable en este experimento.

Otra limitación de la resolución alcanzable reside en el software. Algunos elementos del procesamiento de imágenes SPA crio-EM de uso general no admiten voltajes de aceleración HVEM. Gctf63 no se utilizó porque no admite datos de 1 MV y, de la misma manera, la ponderación de dosis de datos de 1 MV no es compatible ni con MotionCor264 ni con la implementación de RELION65, ya que actualmente no existen parámetros para el daño por radiación a 1 MV. Afortunadamente, CTFFIND66 admite datos de 1 MV para la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF), por lo que lo utilizamos en este estudio. No pudimos utilizar ponderación de dosis, aunque esto se compensa en cierta medida con voltajes de aceleración más altos, lo que reduce el daño radical67. El pulido de partículas en RELION65 también proporciona pocos beneficios, lo que puede deberse al gran tamaño de los virus en la micrografía, donde las distorsiones en la micrografía pueden causar una variación de la deformación del virus por cuadro. La corrección de esfera de Ewald de partículas enteras, implementada recientemente en el paquete de software RELION65, también ha demostrado mejorar las reconstrucciones con microscopios de 300 kV en una variedad de diámetros. Probamos la corrección de la esfera de Ewald para nuestra reconstrucción de tokiovirus tomada con el crio-HVEM de 1 MV y no encontramos ninguna mejora. Esto puede deberse a que la reconstrucción de 7,7 Å del tokiovirus no tiene una resolución lo suficientemente alta como para beneficiarse. El soporte de software mencionado anteriormente, en particular la ponderación de dosis, será necesario en el futuro para SPA de alta resolución de virus gigantes utilizando microscopios de 1 MV.

En última instancia, el uso de crio-HVEM proporciona beneficios para partículas más grandes. La disminución del gradiente de desenfoque a través de una partícula ayuda a la reconstrucción completa de la partícula en alta resolución. También se reduce el daño a la muestra causado por el haz de electrones, lo cual es de particular importancia en el caso de muestras biológicas. Además, una mayor penetración del haz permite una mejor visualización de la estructura interna, como se utiliza en la tomografía crioelectrónica con pithovirus, un virus gigante con forma de ánfora que tiene un espesor de ~ 800 nm8. Más allá del crio-EM de 300 kV, más disponible, permite el estudio de detalles más finos de virus aún más grandes, que los voltajes de aceleración más bajos no pueden penetrar. Finalmente, la metodología de reconstrucción es más simple que la de la reconstrucción basada en bloques. La reconstrucción basada en bloques es una técnica poderosa, pero como su nombre lo indica, divide toda la estructura en bloques. Unirlos nuevamente se llama mapa compuesto y, si bien están ganando popularidad, tienen algunos peligros inherentes. Por ejemplo, los cálculos FSC no se pueden realizar en mapas compuestos sin artefactos, y la nitidez puede revelar artefactos superpuestos entre mapas. Probamos la reconstrucción basada en bloques en conjuntos de datos de crio-HVEM, pero no mejoró la resolución alcanzada. Aunque se desconocen las razones exactas, nuestra hipótesis de trabajo es que el número relativamente bajo de partículas en la reconstrucción final y la menor curvatura de la esfera de Ewald a 1 MV (en comparación con 300 kV) disminuye la efectividad de la reconstrucción basada en bloques. Sin embargo, los métodos de reconstrucción basados en bloques pueden tener algunas ventajas en crio-HVEM si se cuenta con un número suficiente de partículas. Esto se debe a que puede superar distorsiones menores de partículas simétricas muy grandes, lo que produce resoluciones mejoradas. Para objetos con baja simetría todavía se necesita el método directo que utiliza electrones de mayor aceleración.

La estructura de la cápside de 7,7 Å del tokiovirus representa una nueva red de cápside del NCLDV. Las matrices trapezoidales de LtC en tokyovirus no forman una única capa subyacente debajo del MCP, como las mCP de PBCV-115 o ASFV16, sino que dependen de otra CmC que conecta los tres trapecios rotados dentro del trisimetron (Fig. 5, S7). Dos componentes proteicos de GlC y ZpC están presentes en las interfaces trisimetron en lugar de una sola proteína (P11) como en PBCV-1. SuC también interactúa con cada red trapezoidal en la superficie interior y además forma una conexión con las ScPC, que no parece estar presente en las reconstrucciones de PBCV-1 y ASFV.

La cápside T = 309 (h = 7, k = 13) se muestra claramente en la reconstrucción 3D (Fig. 3). Con esta estructura, podemos identificar recientemente una matriz de componente proteico "andamio" (ScPC) intermedia entre la cápside y la membrana interna (amarilla en las figuras 4 y 5). Pares antiparalelos de ScPC corren a lo largo de la interfaz trisimómetro y se conectan con cada pentasimómetro a través de los componentes del pentasimómetro. Estas características son bastante análogas a las proteínas de “cinta métrica”40 informadas en los mapas crio-EM de PBCV-1 y ASFV15,16, que es la mCP filamentosa larga denominada P2 en PBCV-1 y M1249L en ASFV. Esto sugiere que la construcción de la cápside del tokiovirus puede ocurrir mediante un mecanismo diferente. La presencia de esta red de andamio puede indicar que el andamio es responsable de imponer restricciones a las dimensiones de la cápsida. Se necesitará una mayor claridad de estos ScPC flexibles para dilucidar sus interacciones con más detalle y tal vez arrojar más luz sobre su papel potencial en la construcción.

Para construir el modelo de homología de MCP, extrajimos el trímero de MCP central de un trisimómetro y el modelo de homología se instaló en un cuerpo rígido en la densidad. Las regiones del modelo de homología que no se ajustan bien a la densidad se arreglaron manualmente usando COOT58 y se refinaron energéticamente con el software PHENIX59 (Fig. 6B). Una región de "tapa" vacía estaba presente en cada densidad de trímeros de MCP cuando se le ajustó el modelo de homología de MCP, aunque hasta ahora no hemos podido aclarar esta región lo suficiente para el ajuste del modelo. Como tal, inicialmente no estábamos seguros de si esta densidad es causada por otras proteínas más pequeñas que interactúan con la MCP o por una modificación postraduccional de la MCP. Identificamos un candidato de la proteína de "cápsula pequeña", ya que se utilizó la tinción con ácido periódico de Schiff (PAS)61 en SDS-PAGE de partículas de tokiovirus purificadas para identificar glicoproteínas potenciales. Esto mostró una proteína que funciona a ~ 14 kDa (Fig. S5B). Sin embargo, la banda es débil en comparación con la de MCP en el gel teñido con Coomassie (Fig. S5A). Es posible que la densidad de la capa no esté presente para todos los trímeros MCP, lo que se denomina "ocupación parcial" y, como resultado, el promedio icosaédrico afectará su claridad. En el caso del PBCV-1, las cadenas de azúcar están unidas directamente al MCP53, mientras que en el caso del ASFV, hay una segunda membrana externa a la propia cápside16, por lo que la glicosilación adicional de la cápside es menos importante. Anteriormente descubrimos que algunas especies de la familia Marseilleviridae inducen la formación de racimos en la ameba huésped20. Al mismo tiempo, los virus recién nacidos se adhirieron y se alinearon en la superficie de la célula huésped en el proceso. Un miembro de Mimiviridae, el tupanvirus, también tiene evidencia que sugiere este mecanismo similar, donde se sugirió que una proteína de unión a manosa (MBP) expresada en la membrana celular de la ameba estaba involucrada en las adherencias intercelulares68. En los virus de Marsella, se informó que 10 de las 49 proteínas del virión identificadas estaban glicosiladas18. La glicoproteína puede desempeñar un papel en la formación de estos grupos y en su adhesión a la célula, potencialmente para aumentar la velocidad de transmisión, pero es necesario realizar más estudios para aclarar la función precisa.

Los pentones de tokiovirus y PBCV-1 son similares en profundidad (Fig. S2A, B). Como la densidad de pentón del tokiovirus se ajusta a la del modelo PDB derivado de crio-EM de PBCV-1 (PDBID: 6NCL) (Fig. S2D), podemos encontrar una densidad presente para la proteína base de pentón y un nivel de región inferior no modelado. con la capa mCP. Lo mismo es evidente en PBCV-1 (Fig. S2E). La proteína pentona del ASFV (Fig. S2F) ajusta el rollo de gelatina único en la misma posición y orientación que la pentona del PBCV-1, con el dominio de inserción en la cara exterior de la cápside en densidad, que ni el PBCV-1 ni el tokiovirus poseen. densidad clara. Una búsqueda BLAST del genoma del tokiovirus, utilizando tanto la pentona PBCV-1 como la pentona mavirus dependiente de Cafeteriavirus que se modeló en la estructura de la pentona ASFV, no arrojó ninguna coincidencia, por lo que no ha sido posible la identificación y el modelado de homología de la proteína pentona. . Dadas las bajas métricas de BLAST para el tokiovirus MCP contra PBCV-1 y mavirus (Tabla 2), esto no es necesariamente sorprendente. Para aclarar la naturaleza de la proteína que ocupa la región inferior del pentón, debemos lograr una reconstrucción de mayor resolución.

Inmediatamente alrededor de este pequeño pentámero hay una matriz simétrica de otros componentes proteicos de PC-α, β y γ dentro de la capa de mCP, que actúan para soportar la matriz de MCP en el pentasimómetro como reemplazo de las proteínas de la red e interactúan con la extrusión de la membrana interna. a través de materiales de baja densidad (flechas en las Figs. 3C y 5A). Pueden ser más o menos análogas a las proteínas "linterna" del ASFV16. Estos se extienden aún más hasta el borde del pentasimómetro e interactúan con la matriz ScPC (Fig. 4B). Esta es una estructura novedosa en NCLDV y probablemente desempeñe un papel en la formación de la extrusión de la membrana interna.

En conclusión, basándonos en la estimación de la resolución teórica, aplicamos crio-HVEM de 1 MV al análisis de partículas individuales de tokiovirus, que es una partícula de virus grande con un diámetro máximo de 250 nm. Esto reveló la estructura de la cápside de 7,7 Å con una cantidad limitada de datos sin utilizar una técnica de reconstrucción basada en bloques. El mapa crio-EM mostró la nueva red de la cápside que permite las características extrusiones de la membrana interna debajo de los vértices icosaédricos. La matriz ScPC avanzada representa un marco que soporta la estructura extruida de la membrana interna y posiblemente también funcione como una proteína de cinta métrica reportada en otros NCLDV. También es probable que las exclusivas PC-α, β y γ soporten las extrusiones de la membrana. Si bien comparte muchas similitudes con las estructuras de PBCV-1 y ASFV con respecto a la estructura de MCP, encontramos una densidad de capa en la parte superior de la MCP que se sugirió que contenía una glicoproteína. La glicoproteína identificada en Marseilleviridae posiblemente actúa para interactuar con la superficie de la célula huésped. Esto, a su vez, puede provocar la formación de grupos de células huésped en algunas especies, como se ha demostrado previamente20. El crio-HVEM de 1 MV instalado en la Universidad de Osaka tuvo un rendimiento suficiente para alcanzar la resolución teórica, pero la resolución actual de la cápside del tokiovirus estaba limitada a 7,7 Å. Uno de los principales problemas fue la cantidad limitada de datos. Esto se solucionará en el futuro instalando un software de adquisición de datos automatizado. Usar un detector de formato más grande o mejorar el rendimiento de súper resolución del detector Gatan K2 cuando se combina con HVEM también solucionará el problema, porque la caída significativa en la señal de baja frecuencia en el modo de súper resolución a 1 MV puede ser una limitación de la estimación de súper resolución. algoritmo para electrones de mayor energía en el detector K2 actual (Fig. S1). Otro problema importante es el soporte limitado del software para micrografías de 1 MV. Si se pueden utilizar las técnicas avanzadas actuales, como la ponderación de dosis durante la corrección del movimiento y el pulido de partículas bayesianas, y se puede optimizar el refinamiento completo de los parámetros CTF, la combinación de todas ellas debería permitir que la resolución se acerque al valor teórico. Serán necesarias más optimizaciones y evaluaciones analíticas detalladas para resolver los problemas identificados en este estudio para que el crio-HVEM utilice una fuente de electrones LaB6 para el análisis estructural de grandes muestras biológicas. Para distinguir las limitaciones de resolución de crio-HVEM, también debemos probar SPA utilizando muestras bien probadas, como apoferritina, TMV y/o GroEL. Además, las comparaciones cuidadosas con el crio-EM criogénico de 300 kV ayudarían a demostrar el potencial del crio-HVEM en el futuro.

Tokyovirus29 fue proporcionado originalmente por el profesor Masaharu Takemura, de la Universidad de Ciencias de Tokio. Se propagó en células de Acanthamoeba castellanii cultivadas en medio PYG (peptona proteosa al 2% p/v, extracto de levadura al 0,1% p/v, MgSO4 4 mM, CaCl2 0,4 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 0,05 mM, 2,5 mM. Na2HPO4, KH2PO4 2,5 mM, sacarosa 100 mM, pH 6,5). Los virus se purificaron como se describió anteriormente27,28. En resumen, el líquido de cultivo infectado se recogió y se centrifugó durante 10 minutos a 1500 g, 4 °C para eliminar las células muertas, antes de que el sobrenadante se centrifugara durante 35 minutos a 10 000 g, 4 °C. El sedimento se suspendió en 1 ml de tampón PBS y se cargó en un gradiente de sacarosa del 10 al 60 %, antes de una centrifugación adicional durante 90 minutos a 8000 g, 4 °C. La banda concentrada se extrajo y se dializó en PBS antes de una ronda adicional de centrifugación con las mismas condiciones. El sedimento se suspendió en PBS antes de preparar las rejillas crio-EM.

Se trató una muestra del tokiovirus purificado con tampón de muestra SDS-PAGE (2332330/AE-1430 EzApply, ATTO) y se hirvió durante 5 minutos. Se cargaron 10 μg de cada muestra desnaturalizada en un pocillo (2331635/CHR12.5L c, ATTO) y se procesaron 7 μl de marcador molecular estándar (2332340/AE-1440, ATTO) para estimar los pesos moleculares de las bandas de proteínas resultantes. La electroforesis se realizó a una corriente constante de 10,5 mA con un tampón de electroforesis (2332323/WSE-7055, ATTO) utilizando un sistema de electroforesis (2322240/WSE-1010, ATTO). El gel resultante se tiñó con un regente (2332370/AE-1340, ATTO). La tinción con ácido periódico de Schiff se llevó a cabo según el protocolo descrito en el kit de tinción PAS (GlycoGel Stain Kit 24693-1, PSI).

Se utilizó un crio-HVEM JEOL JEM-1000EES (JEOL Inc.) instalado en el centro de investigación de ultra-HVEM de la Universidad de Osaka. El microscopio estaba equipado con un cañón de electrones de filamento LaB6 a un voltaje de aceleración de 1 MV, una etapa de carga automática que puede mantener hasta 12 rejillas EM hidratadas congeladas en condiciones criogénicas y una cámara detectora directa K2 IS (Gatan Inc.). La etapa y almacenamiento de la muestra siempre se enfrió con nitrógeno líquido que se repone automáticamente. Los datos de las imágenes se recogieron manualmente. Para la prueba de límite de resolución del crio-HVEM de 1 MV, se tomaron imágenes de una película Pt-Ir (JEOL Inc.) con un aumento nominal de 100.000 × (0,22 Å/píxel en la muestra) y un desenfoque de 0,6 a 2 μm. Las imágenes de película se grabaron en una cámara K2 IS en modo de conteo a una tasa de dosis de ~ 8 e-/píxel/s con 0,2 s/cuadro durante 1 s de exposición. Los fotogramas completos con corrección de movimiento se sumaron con el software DigitalMicrograph (Gatan Inc). Para la prueba de calidad de imagen, las curvas MTF y DQE se midieron utilizando la sombra de una hoja metálica de tope de haz tanto en el modo de conteo como en el modo de superresolución del Gatan K2 IS en el crio-HVEM. Los datos fueron procesados con FindDQE69. A modo de comparación, los datos se recopilaron en las mismas condiciones utilizando una cámara Titan Krios G2 (Thermo Fisher Scientific) de 300 kV y una cámara K2 Summit instalada en el instituto.

Se colocó una alícuota (2,5 μL) de las partículas de tokiovirus purificadas en rejillas Quantifoil R 1.2/1.3 (Quantifoil Micro Tools) que se descargaron mediante descarga luminosa utilizando un bombardero de iones de plasma (PIB-10, Vacuum Device Inc.) inmediatamente antes. Luego se secó esta rejilla (tiempo de transferencia: 10 s, fuerza de transferencia: 10) y se congeló por inmersión usando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) con una configuración de 95% de humedad y 4 °C. Se recogieron manualmente un total de 304 micrografías utilizando un JEOL JEM-1000EES (JEOL Inc.) equipado con una etapa de carga automática y una cámara K2 Summit (Gatan Inc.) optimizada para 1 MV HVEM en un total de siete sesiones utilizando tres cuadrículas. Los fotogramas de película de micrografía se recogieron en modo de superresolución con un aumento equivalente a 1,456 Å/píxel con un desenfoque objetivo de 2 a 4 μm. Cada exposición fue de 32 s, con un intervalo de fotograma de 0,2 s para un total de 160 fotogramas por micrografía. Los marcos se apilaron utilizando EMAN270.

Las películas de micrografías se importaron a una versión beta de RELION 3.1, antes de la corrección de movimiento con la implementación RELION65 de MotionCor264. La corrección del movimiento se realizó utilizando parches de 5 × 5 con un factor de desenfoque B de 500 Å2. La estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) de las imágenes se realizó utilizando CTFFIND 4.1.1066 con los siguientes parámetros: límite inferior de desenfoque, 2500 Å; límite superior de desenfoque, 80.000 Å; tamaño de paso, 100; búsqueda exhaustiva. Después de la primera ejecución utilizando un tamaño de caja de 512, se seleccionaron buenos ajustes CTF y los ajustes fallidos se volvieron a ejecutar utilizando un tamaño de caja FFT más grande. Esto se repitió hasta un tamaño de caja FFT de 2048. Otros parámetros se dejaron en la configuración predeterminada. Después de este punto, las micrografías que no lograron encontrar un buen ajuste fueron descartadas. Definimos un ajuste CTF "bueno" como aquel que tiene anillos Thon distinguibles y con los que se alinea el espectro de potencia simulado. Esto dio como resultado un total de 156 micrografías. Se recogieron manualmente 1529 partículas, se extrajeron con una reducción de resolución 4× a 5,824 Å/píxel (los cuadros de 2400 × 2400 píxeles se convierten en cuadros de 600 × 600 píxeles) y se clasificaron en 2D en 40 clases con un diámetro de máscara circular de 2600 Å, muestreo angular de 2° ( aumentó automáticamente a 3,75° debido al uso de la aceleración de GPU) y un rango de búsqueda de 7 píxeles. Se trasladaron 1458 partículas en buenas clases y se clasificó 2D por segunda vez con un muestreo angular de 1° (aumentado automáticamente a 1,825°) y se permitió “ignorar CTF hasta el primer pico”, lo que resultó en 1419 partículas en buenas clases. Todo el procesamiento 3D se llevó a cabo imponiendo simetría icosaédrica. Se generó un modelo inicial con el algoritmo de descenso de gradiente estocástico en RELION 3.1. Estas partículas se pasaron a la clasificación 3D en 5 clases, utilizando un muestreo angular de 1,8° para 25 iteraciones, seguido de un muestreo angular de 0,5° para 25 iteraciones más. Se seleccionaron las dos mejores clases, con un total de 1.297 partículas. El refinamiento 3D se llevó a cabo utilizando únicamente una máscara esférica. Las partículas se volvieron a extraer y se volvieron a centrar con una reducción de resolución de 3 × (4,368 Å/píxel) y se refinaron aún más, luego se volvieron a extraer y se volvieron a centrar con una reducción de resolución de 2 × (2,912 Å/píxel). Se llevaron a cabo refinamientos de anisotropía de magnificación y refinamiento de CTF, mejorando la resolución alcanzada. La clasificación 3D en 5 clases con la alineación desactivada se llevó a cabo utilizando una máscara que bloquea el volumen interno desordenado (ADN viral) y se seleccionó la mejor clase que comprende 1182 partículas. El pulido de partículas tuvo un efecto insignificante cuando se utilizó. La resolución final posterior al proceso depende en gran medida de la máscara utilizada: una máscara de solo cápside da como resultado una resolución estimada de 7,7 Å, incluidas las proteínas de la estructura y la membrana interna la reduce a 8,7 Å. Una máscara esférica suave proporciona una resolución de 9,4 Å. La resolución local se calculó utilizando el módulo blocres de Bsoft71 sin aplicar máscara. El camino completo a través de la reconstrucción SPA 3D se resume en la Fig. S6.

La proteína MCP del tokiovirus se identificó a partir del genoma informado anteriormente. BLASTP72 comparó la secuencia primaria de aminoácidos del MCP del virus de Tokio con la de otros NCLDV, y se utilizaron los servidores SWISS-MODEL57 e I-TASSER73 para generar un modelo de homología utilizando el modelo MCP de PBCV-1 (PDBID: 5TIP)53 como una plantilla. Este modelo de homología era un cuerpo rígido encajado en un trímero MCP de tokiovirus extraído del triple eje de simetría y las secciones del modelo que se encontraban fuera de la densidad fueron ajustadas por COOT58 y refinadas energéticamente por PHENIX59. El punto central del trisimómetro se identificó visualmente y se extrajo utilizando la herramienta Volume Eraser en UCSF Chimera60, luego el volumen se recortó a 1003 píxeles. El modelo resultante fue guardado. El mapa de trisimetron se segmentó utilizando el módulo SEGGER74 de USCF Chimera y los segmentos que se superponían al modelo se guardaron en un volumen separado. Para la proteína base de pentona, la estructura PDB de la pentona de PBCV-115 se ajustó al centro del eje quíntuple y se usó SEGGER para extraer la región. Esto también seleccionó a la mayoría de los cinco MCP adyacentes. Por lo tanto, se utilizó molmap en UCSF Chimera60 para generar un mapa molecular de 15 Å, y el mapa se pasó al módulo relion_mask_create de RELION 3.1 para generar una máscara binaria con una extensión de 5 píxeles y un borde suave de 5 píxeles. Luego se impuso la máscara sobre la región extraída.

Las reconstrucciones 3D del tokiovirus se visualizaron utilizando el módulo relion_display de RELION 3.150 o UCSF Chimera60, según la dimensionalidad. Los espectros de potencia de Pt-Ir se visualizaron utilizando Fiji75 y los promedios rotacionales se calcularon utilizando el complemento Radial Profile Extended.

Las reconstrucciones crio-HVEM se cargaron en EMDB y están disponibles en los siguientes códigos de acceso, 30797: máscara de postproceso de cápside únicamente, 7,7 Å, 30798: máscara de postproceso de cápside, andamio y membrana interna, 8,7 Å, 30799 ; Máscara post-proceso esférica blanda, 9,4 Å.

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Agradecemos a Masaharu Takemura por su lectura crítica y valiosas sugerencias, y a Yoko Kayama por la recopilación inicial de datos crio-EM. Este trabajo fue apoyado por MEXT KAKENHI (JP19H04845 a K.Mu.), la Investigación Conjunta de ExCELLS (20-004, 22EXC601 a K.Mu.), el Programa de Estudios Cooperativos del Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas (20-239 a K. .Mu.), SOKENDAI (a AC), Vetenskapsrådet (VR)/El Consejo Sueco de Investigación (2018-03387 a KO), la Fundación Sueca para la Cooperación Internacional en Investigación y Educación Superior (STINT) (JA2014-5721 a Janos Hajdu y KO), beca de investigación FORMAS del Consejo Sueco de Investigación en Medio Ambiente, Ciencias Agrícolas y Planificación Espacial (2018-00421 a KO), la Real Academia Sueca de Ciencias (BS2018-0053 a KO).

Estos autores contribuyeron por igual: Akane Chihara y Raymond N. Burton-Smith.

Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Graduados en Estudios Avanzados (SOKENDAI), Okazaki, Aichi, Japón

Akane Chihara, Chihong Song y Kazuyoshi Murata

Centro de Investigación Exploratoria sobre Vida y Sistemas Vivos (ExCELLS), Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, Okazaki, Aichi, Japón

Akane Chihara, Raymond N. Burton-Smith, Chihong Song y Kazuyoshi Murata

Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, 38 Nishigonaka, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8585, Japón

Akane Chihara, Raymond N. Burton-Smith, Chihong Song y Kazuyoshi Murata

Centro de Investigación de Microscopía Electrónica de Ultra Alto Voltaje, Universidad de Osaka, Ibaraki, Osaka, Japón

Naoko Kajimura y Kaoru Mitsuoka

Programa de Biofísica Molecular, Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Kenta Okamoto

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Correspondencia a Chihong Song o Kazuyoshi Murata.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chihara, A., Burton-Smith, RN, Kajimura, N. et al. Una nueva red de proteínas de la cápside permite la estructura de membrana interna característica de los virus gigantes Marseilleviridae. Representante científico 12, 21428 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24651-2

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Recibido: 21 de mayo de 2022

Aceptado: 18 de noviembre de 2022

Publicado: 11 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24651-2

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